构建单细胞表观基因组图谱
在单细胞水平上表征神经类器官发育过程中组蛋白修饰和转录组的动态变化。
对5个iPSC细胞系在6个时间点的脑类器官和1个细胞系在2个时间点的视网膜类器官，进行scCUT&Tag（H3K27ac、H3K27me3、H3K4me3）和scRNA-seq分析，并通过UMAP降维、聚类和标签转移进行细胞状态注释。
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人类神经类器官系统中从多能性出发的发育轨迹的单细胞表观基因组重建
Single-cell epigenomic reconstruction of developmental trajectories from pluripotency in human neural organoid systems
实验完整度
高包含多时间点类器官scCUT&Tag和scRNA-seq，整合多组学以及EED抑制剂功能扰动实验，并用原代胎脑多组学数据进行验证，证据层级包括体外模型和原代组织验证。
主要模型
人类大脑类器官 人类视网膜类器官 人类胎儿脑组织（19孕周）
重点核对
类器官时间点：第5、15、35、60、120、240天（脑），第45、85天（视网膜） 细胞系：409b2-iCRISPR、HOIK1、WIBJ2、WTC、B7 EED抑制剂A395浓度：1 µM、3 µM、10 µM A395处理时间窗口：第0至15天或第0至18天 原代脑组织样本：19孕周胎儿端脑
摘要
多能祖细胞的细胞命运进程受到严格调控，从而产生高度多样的人类细胞。表观遗传修饰也协调细胞命运的限制。揭示人类细胞多样性背后的表观遗传机制一直很困难。在本研究中，我们使用人类大脑和视网膜类器官模型，并展示了从祖细胞到分化神经命运的H3K27ac、H3K27me3和H3K4me3组蛋白修饰的单细胞分析，以重建调控细胞身份获得的表观基因组轨迹。我们捕获了从多能性通过神经上皮到视网膜和大脑区域及细胞类型特化的转变。抑制性和激活性表观遗传修饰的转换可以在每个阶段先于并预测细胞命运决定，提供了基因调控元件和转录因子的时间普查。在神经外胚层阶段去除H3K27me3会破坏命运限制，导致异常的细胞身份获得。我们的人类神经类器官发育的单细胞表观基因组图谱可作为探索人类细胞命运决定的蓝图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类细胞命运决定过程中，表观遗传修饰（特别是组蛋白修饰）如何调控从多能性到神经细胞特化的命运转换？
- 核心机制
- H3K27me3介导的抑制性标记在神经上皮阶段对于维持细胞命运限制至关重要，其缺失导致抑制性标记丢失、激活标记获得，促使细胞偏向非神经外胚层和神经嵴等异位命运。
- 主要证据
- 基于类器官时间过程的单细胞表观基因组图谱，结合EED抑制剂处理实验，显示H3K27me3耗竭后细胞组成改变，并通过原代胎脑数据验证了表观遗传预编程现象。
- 研究意义
- 该研究提供了人类神经类器官发育的单细胞表观基因组图谱，可作为探索人类细胞命运决定的蓝图，有助于理解神经发育过程中的表观遗传调控机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析区域特化过程中的表观遗传开关
探究神经上皮分化为不同脑区和视网膜命运时组蛋白修饰的转换规律。
利用CellRank计算末端命运概率，构建分化轨迹图，分析区域特异性转录因子基因上的组蛋白修饰变化，并鉴定双价域和H3K27me3/H3K27ac转换峰。
重建端脑神经元分化轨迹
揭示从多能性到端脑神经元分化过程中组蛋白修饰与基因表达的时序关系。
构建从PSC到端脑神经元的拟时间轨迹，对基因表达和组蛋白修饰进行聚类，发现神经元基因在表达前先获得激活标记，即表观遗传预编程现象。
验证原代胎儿脑组织中的表观遗传预编程
验证类器官中观察到的神经元基因表观遗传预编程是否在原代人类脑组织中存在。
对19孕周人类胎儿端脑组织进行scRNA-seq和scATAC-seq多组学分析（scMultiome），并检测神经元基因（如NEUROD2）的染色质可及性是否先于表达增加。
EED抑制剂扰动实验
验证H3K27me3在早期神经发育中维持细胞命运限制的功能。
从第0-15天或0-18天用EED抑制剂A395处理类器官，通过scRNA-seq和bulk CUT&Tag分析H3K27me3耗竭对细胞状态和基因表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354277 |
| mTeSR Plus培养基 | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
| TryplE消化液 | Gibco | 12605010 | |
| EDTA | Gibco | 15575020 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| mFreSR冻存液 | STEMCELL Technologies | 05855 | |
| Venor GeM Classic支原体检测试剂盒 | Minerva Biolabs | -- | |
| 96孔超低吸附板 | Corning | CLS7007 | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 31331-028 | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| 药物处理 | A395 | MedChemExpress | HY-101512 |
| 单细胞悬液制备 | 无钙镁HBSS缓冲液 | STEMCELL Technologies | 37250 |
| 木瓜蛋白酶神经解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| CryoStor CS10冻存液 | STEMCELL Technologies | 07930 | |
| scCUT&Tag | 洋地黄皂苷 | Thermo Fisher Scientific | BN2006 |
| HEPES | Jena Bioscience | CSS-511 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S6546 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| 牛血清白蛋白 | Miltenyi Biotec | 30-091-376 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | 303410 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | 11873580001 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Flowmi过滤器 | Sigma-Aldrich | BAH136800040 | |
| Countess细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 | |
| 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- | |
| bulk CUT&Tag | 伴刀豆球蛋白A磁珠 | Polysciences | 86057-3 |
| ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| λDNA | New England Biolabs | N3011S | |
| NEBNext高保真2×PCR预混液 | New England Biolabs | M0541S | |
| AMPure磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit DNA高灵敏度定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| TapeStation | Agilent | 5067-4626 | |
| scRNA-seq | DMEM/F-12培养基 | Gibco | 31330038 |
| 胎牛血清 | Merck | ES-009-B | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Human TruStain FcX封闭液 | BioLegend | 422302 | |
| TotalSeq细胞哈希抗体 | BioLegend | -- | |
| Western blot | Laemmli样本缓冲液 | 文中未明确说明 | -- |
| Fisherbrand电动研磨器 | Fisherbrand | 12-141-368 | |
| Diagenode Bioraptor Plus超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| iBright成像系统 | Invitrogen | -- | |
| 丽春红 | Sigma-Aldrich | P7170-1L | |
| 免疫染色 | 蔗糖 | 文中未明确说明 | -- |
| 冷冻包埋模具 | Sakura | 4565 | |
| Tissue-Tek O.C.T.包埋剂 | Sakura | 16-004004 | |
| Cryostar NX70冷冻切片机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HistoVT One抗原修复液 | Nacalai | 06380 | |
| DAPI | 文中未明确说明 | -- | |
| Prolong Glass抗淬灭封片剂 | 文中未明确说明 | -- | |
| Nikon Ti2转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| Zeiss LSM 980共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| scCUT&Tag抗体 | H3K27me3兔抗体 | Diagenode | C15410195 |
| H3K27ac兔抗体 | Diagenode | C15410196 | |
| H3K27ac小鼠单克隆抗体 | GeneTex | GTX50903 | |
| H3K4me3兔抗体 | Diagenode | C15410003 | |
| Western blot抗体 | H3小鼠抗体 | Active Motif | 39763 |
| β-Catenin小鼠抗体 | BD Biosciences | 610154 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官培养 | 细胞系来源、培养基、基质胶、时间点 阅读提示：Methods: Cell and organoid culture |
| 药物处理 | A395浓度（1 µM、3 µM、10 µM）、处理时间（第0-15天或0-18天）、细胞系 阅读提示：Methods: Drug treatment |
| scCUT&Tag | 细胞数、抗体、Tn5、缓冲液、PCR循环数 阅读提示：Methods: scCUT&Tag |
| 单细胞RNA测序 | 细胞数、捕获、测序深度 阅读提示：Methods: Hashing and scRNA-seq |
| 数据分析 | 参数设置（如聚类分辨率、拟时间方法） 阅读提示：Methods: Data processing for scRNA-seq, Pre-processing and clustering of scCUT&Tag data, Graph representation of regional diversification |