筛选DDX/DHX家族在I/R中的表达变化
鉴定参与肝脏I/R损伤的DDX/DHX家族成员。
利用转录组分析比较肝脏I/R后DDX/DHX家族成员的表达，发现Dhx58显著下调，并验证其在肝细胞中的表达及I/R后的蛋白和mRNA水平下降。
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干扰素-α刺激DExH-box解旋酶58预防肝细胞铁死亡
Interferon-α stimulates DExH-box helicase 58 to prevent hepatocyte ferroptosis
实验完整度
高包含体外细胞实验、肝细胞特异性基因敲除小鼠、转录组学、蛋白质组学、RIP-seq等多项独立证据，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
肝细胞特异性Dhx58敲除小鼠（Dhx58hep−/−） 原代肝细胞 人肝组织样本 小鼠肝脏I/R模型
重点核对
肝细胞特异性Dhx58敲除小鼠的构建及验证 小鼠肝脏I/R模型的建立：雄性8-10周龄，夹闭肝动脉、门静脉和胆管60分钟 IFN-α预处理：腹腔注射1×10^6 U/kg，术前12小时 铁死亡抑制剂liproxstatin-1的使用（10 mg/kg）
摘要
背景：肝脏缺血/再灌注(I/R)损伤通常由肝脏手术中的肝血流阻断引起，在战伤和创伤中常见。肝细胞铁死亡在肝脏I/R损伤中起关键作用，然而，DEAD/DExH-box解旋酶(DDX/DHX)家族成员是否控制或调节这一过程仍不清楚。方法：通过转录组分析筛选肝脏I/R损伤期间DDX/DHX家族成员的表达。构建了肝细胞特异性Dhx58基因敲除小鼠，并进行部分肝脏I/R手术。I/R后肝脏的单细胞RNA测序(scRNA-seq)提示Dhx58hep−/−增强了铁死亡。通过RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)和免疫沉淀-质谱(IP-MS)筛选了与DExH-box解旋酶58(DHX58)相关的mRNA和蛋白质。结果：活性氧(ROS)的过量产生降低了肝细胞中干扰素刺激基因Dhx58的表达，并促进了肝脏铁死亡，而IFN-α治疗增加了DHX58表达并在肝脏I/R损伤期间防止了铁死亡。机制上，具有RNA结合活性的DHX58与谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)(一种重要的铁死亡抑制因子)的mRNA组成性结合，并招募m6A阅读蛋白YT521-B同源结构域包含蛋白2(YTHDC2)以m6A依赖性方式促进Gpx4 mRNA的翻译，从而提高GPX4蛋白水平并预防肝脏铁死亡。结论：本研究提供了IFN-α刺激DHX58促进m6A修饰的Gpx4 mRNA翻译的机制证据，提示IFN-α在预防肝脏I/R损伤期间肝细胞铁死亡方面的潜在临床应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DDX/DHX家族成员是否调节肝脏I/R损伤中的肝细胞铁死亡，以及其潜在机制。
- 核心机制
- 肝细胞中ROS过量产生导致ISG Dhx58表达下降，从而促进铁死亡；DHX58通过其RNA结合活性与Gpx4 mRNA结合，招募m6A阅读蛋白YTHDC2，以m6A依赖性方式促进Gpx4 mRNA的翻译，上调GPX4蛋白水平，抑制铁死亡。
- 主要证据
- Dhx58hep−/−小鼠在I/R后表现出更严重的肝损伤和铁死亡指标（铁积累、脂质过氧化、GSH/GSSG比值降低等）；RIP-seq和IP-MS显示DHX58结合Gpx4 mRNA并与YTHDC2相互作用；IFN-α预处理上调DHX58和GPX4，减少铁死亡，且该保护效应在Dhx58hep−/−小鼠中消失。
- 研究意义
- 研究为IFN-α通过DHX58预防肝脏I/R损伤中的肝细胞铁死亡提供了机制证据，提示IFN-α可能作为预防肝脏I/R损伤的潜在临床策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ROS对DHX58表达的调控
探讨I/R诱导的ROS是否导致DHX58表达下降。
用H2O2处理原代肝细胞和人肝细胞系HHL5，或用ROS清除剂NAC/BHA处理小鼠和细胞，检测DHX58表达；也使用Nrf2激活剂DMF。
构建肝细胞特异性Dhx58敲除小鼠并评估I/R损伤
确定DHX58缺失对肝脏I/R损伤和铁死亡的影响。
利用CRISPR/Cas9技术构建Dhx58f/f小鼠并与Alb-Cre小鼠杂交获得Dhx58hep−/−小鼠，进行部分肝脏I/R手术，评估肝损伤、炎症和铁死亡指标。
单细胞RNA测序分析Dhx58hep−/−肝脏
在单细胞水平上分析Dhx58缺失对I/R后肝脏细胞类型和铁死亡通路的影响。
对Dhx58f/f和Dhx58hep−/−小鼠I/R后的肝脏进行scRNA-seq，分析细胞聚类、铁死亡相关基因集富集及细胞间通讯。
验证DHX58对铁死亡的调控
确定DHX58是否通过抑制铁死亡来保护肝脏。
使用铁死亡诱导剂erastin和Fe-NTA处理Dhx58hep−/−小鼠，观察肝损伤和铁死亡指标；使用铁死亡抑制剂liproxstatin-1、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Nec-1，比较哪种抑制能消除Dhx58hep−/−与对照之间的差异。
鉴定DHX58的下游靶标及相互作用蛋白
找出DHX58调控铁死亡的关键下游分子和机制。
通过蛋白质组学比较Dhx58f/f和Dhx58hep−/−肝脏差异蛋白，结合RIP-seq鉴定DHX58结合的RNA，并利用IP-MS鉴定DHX58相互作用蛋白。
验证DHX58与Gpx4 mRNA的结合及对GPX4表达的调控
确认DHX58是否通过结合Gpx4 mRNA促进其翻译。
通过RIP-qRT-PCR验证DHX58与Gpx4 mRNA的结合，检测Dhx58hep−/−和DHX58过表达对GPX4蛋白和mRNA水平的影响，核糖体分析检测Gpx4 mRNA的翻译效率。
研究DHX58招募YTHDC2促进Gpx4 mRNA翻译的机制
阐明DHX58如何以m6A依赖性方式促进Gpx4翻译。
通过Co-IP验证DHX58与YTHDC2的内源结合，敲低Ythdc2或Mettl3评估对GPX4表达和Gpx4 mRNA翻译的影响，利用MeRIP-seq和MeRIP-qRT-PCR确认Gpx4 mRNA的m6A修饰。
验证IFN-α预处理对肝脏I/R损伤的保护作用
评估IFN-α通过诱导DHX58预防铁死亡和肝损伤的潜力。
在I/R或erastin处理前12小时腹腔注射IFN-α，检测DHX58和GPX4表达、肝损伤标志及铁死亡指标，并比较在Dhx58hep−/−小鼠中的效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | COX2 | Cell Signaling Technology | 12282 |
| SLC7A11 | Cell Signaling Technology | 98051 | |
| V5标签 | Cell Signaling Technology | 13202 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 4-羟基壬烯醛 | Abcam | ab46545 | |
| 丙二醛 | Abcam | ab243066 | |
| 淋巴细胞抗原6复合物G位点 | Abcam | ab238132 | |
| F4/80 | Abcam | ab300421 | |
| GPX4 | Abcam | ab125066 | |
| METTL3 | Abcam | ab195352 | |
| ACSL4 | Abcam | ab155282 | |
| YTHDC2 | Abcam | ab220160 | |
| β-肌动蛋白 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Flag标签 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| DHX58 | Proteintech | 11355-1-AP | |
| m6A | Synaptic Systems | 202003 | |
| 流式细胞术 | CD45-Bv605 | Invitrogen | 63-0451-82 |
| CD11b-Percp.cy5.5 | Invitrogen | 45-0112-82 | |
| F4/80-PE | BioLegend | 123110 | |
| Ly6G-FITC | BioLegend | 127605 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白质G琼脂糖 | Sigma-Aldrich | P4691 |
| 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 细胞死亡抑制 | Liproxstatin-1 | SelleckChem | S7699 |
| Z-VAD-FMK | SelleckChem | S7023 | |
| 坏死性凋亡抑制剂-1 | SelleckChem | S8037 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| ROS清除 | N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165 |
| Nrf2激活 | 富马酸二甲酯 | SelleckChem | s2586 |
| 铁死亡诱导 | erastin | -- | -- |
| 铁-氮三乙酸 | -- | -- | |
| IFN-α处理 | 干扰素-α | BioLegend | 752804 |
| scRNA-seq | 10× Genomics Chromium控制器 | 10× Genomics | -- |
| Chromium单细胞3'V3.1试剂盒 | 10× Genomics | -- | |
| 蛋白质组学 | nanoElute超高效液相色谱系统 | Bruker Daltonics | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| Western blot | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Calbiochem | 539134 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 | |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP™ RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| m6A定量 | m6A RNA甲基化定量试剂盒 | Abcam | ab185912 |
| 多聚核糖体分析 | 梯度站 | BioComp | -- |
| ECONO紫外监测器 | BioRad | -- | |
| 馏分收集器 | Gilson | -- | |
| 统计分析 | SPSS 17.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肝脏I/R模型 | 小鼠品系、性别、年龄（8-10周龄）、缺血时间（60分钟）、再灌注时间点 阅读提示：Methods部分，Mouse models |
| Dhx58敲除小鼠构建 | Dhx58f/f小鼠构建方法（CRISPR/Cas9）、Alb-Cre小鼠来源、基因型鉴定方法 阅读提示：Methods部分，Animals |
| IFN-α预处理 | IFN-α剂量（1×10^6 U/kg）、给药途径（腹腔注射）、预处理时间（术前12小时） 阅读提示：Methods部分，Mouse models |
| 铁死亡诱导 | erastin剂量（25 mg/kg）、给药方案（每12小时一次，共2天）；Fe-NTA剂量（22 mg/kg）、给药时间（3小时） 阅读提示：Methods部分，Mouse models |
| ROS清除 | NAC剂量（15 mg/kg）、BHA剂量（50 mg/kg）、给药方式和频率（每日两次，持续2天） 阅读提示：Methods部分，Mouse models |
| 细胞处理 | H2O2浓度、处理时间；H/R条件（缺氧和复氧时间） 阅读提示：Results部分，图1和图2的图注；Methods部分 |