构建3D人类神经免疫轴模型
模拟AD脑环境并加入外周免疫细胞以研究其相互作用和浸润。
使用ReN细胞（含APP/PS1突变）分化4周形成神经元和星形胶质细胞，加入iPSC来源的小胶质细胞，构建PiChip系统，并加入外周血单核细胞（PBMCs）检测其迁移。
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浸润性CD8+ T细胞在三维人类神经免疫轴模型中加剧阿尔茨海默病病理
Infiltrating CD8+ T cells exacerbate Alzheimer's disease pathology in a 3D human neuroimmune axis model
实验完整度
高包含体外3D人类细胞模型、5×FAD小鼠模型，并进行功能验证（损伤表型、耗竭实验）和机制验证（scRNA-seq、信号通路、中和抗体阻断实验）。
主要模型
3D人类神经免疫轴模型（PiChip系统） 5×FAD小鼠模型 原代人外周血单个核细胞（PBMCs）
重点核对
CD8+ T细胞浸润AD培养物导致神经损伤，需在含和不含小胶质细胞条件下分别验证。 CXCL10-CXCR3轴阻断（使用MAB160，10 μg/ml）显著减少T细胞浸润和神经损伤。 渗入的CD8+ T细胞需与微胶质细胞共培养以观察协同致病作用。 使用5×FAD小鼠验证脑内CXCL10表达及CD8+ T细胞浸润。
摘要
脑内浸润的外周免疫细胞及其与脑内驻留细胞的相互作用可能促成阿尔茨海默病（AD）的病理。为研究这些相互作用，在本研究中我们开发了一个三维人类神经免疫轴模型，包含干细胞来源的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，以及外周免疫细胞。我们观察到，与对照组相比，T细胞（而非B细胞）和单核细胞选择性浸润AD培养物的数量增加。CD8+ T细胞浸润AD培养物导致小胶质细胞活化增强、神经炎症和神经退行性变加重。通过单细胞RNA测序，我们确定了T细胞浸润AD培养物导致胶质细胞中干扰素-γ和神经炎症通路被诱导。我们发现C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）及其受体CXCR3在调节AD培养物中T细胞浸润和神经元损伤中起关键作用。该人类神经免疫轴模型是研究外周免疫细胞在脑疾病中作用的有效工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 外周免疫细胞（尤其是T细胞）如何浸润到AD神经病理环境并影响疾病进程？
- 核心机制
- AD病理通过星形胶质细胞释放趋化因子CXCL10，与T细胞表面受体CXCR3结合，促进CD8+ T细胞浸润；浸润的CD8+ T细胞与小胶质细胞协同作用，激活IFN-γ和神经炎症通路，加剧神经退行性病变。
- 主要证据
- 在3D人类神经免疫轴模型中，CD8+ T细胞浸润AD培养物导致小胶质细胞活化和神经损伤，单细胞RNA测序显示IFN-γ和炎症通路上调；阻断CXCL10-CXCR3轴（抗CXCR3中和抗体MAB160）减少T细胞浸润和神经损伤；在5×FAD小鼠脑内也观察到CXCL10和CXCR3+的CD8+ T细胞。
- 研究意义
- 该人类神经免疫轴模型为研究外周免疫细胞浸润在脑疾病中的作用提供了工具，并提示靶向CXCL10-CXCR3轴可能为AD患者减少CD8+ T细胞浸润从而提供潜在治疗干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外周免疫细胞趋化性检测
验证T细胞、单核细胞和B细胞对已知趋化因子的迁移能力及剂量依赖性。
在无神经元细胞的系统中，将趋化因子置于CHEMOKINE隔室，将PBMCs置于PERIPHERAL隔室，用共聚焦延时光学成像定量迁移细胞数和速度。
评估AD环境对PBMC浸润的选择性
确定AD神经病理是否选择性吸引T细胞和单核细胞而不是B细胞。
在3D AD或CTRL神经胶质培养中，将分离的PBMCs加载到外周隔室，通过共聚焦延时光学成像测量浸润迁移指数和速度。
评估浸润T细胞对AD神经病理的影响
研究浸润T细胞（特别是CD8+，与微胶质细胞合作）对神经元和胶质细胞损伤的影响。
在AD培养中加入CD4+或CD8+ T细胞和/或iMGL，定量GFP+面积、细胞体计数、Tuj1和MAP2面积、ALDH1面积、神经密度以及钙成像。
单细胞转录组分析揭示机制
确定T细胞浸润后胶质细胞的转录变化和信号通路激活。
从PiChip脑室收集细胞进行scRNA-seq，分析细胞类型组成、差异表达基因和通路富集（如IFN-γ、抗原提呈）。
鉴定和验证CXCL10及其受体CXCR3的作用
验证CXCL10-CXCR3轴在T细胞浸润和AD神经损伤中的必要性。
检测AD培养和5×FAD脑内CXCL10水平，使用体外趋化实验和阻断实验（抗CXCR3中和抗体MAB160或NBI74330）评估对T细胞浸润和神经损伤的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | ReNcell VM | Millipore Sigma | SCC008 |
| 基质胶 | -- | -- | |
| DMEM-F12培养基 | -- | -- | |
| 微胶质分化 | 人胰岛素溶液 | Millipore Sigma | I9278 |
| 单硫代甘油 | Millipore Sigma | M6145-25 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | A9418 | |
| IDE1 | PeproTech | 1164899 | |
| 芯片制造 | 聚二甲基硅氧烷 | Elsworth Adhesives | Sylgard |
| 细胞培养 | 赫斯特染料 | Thermo Fisher Scientific | 62249 |
| 细胞染色 | CellTracker Orange CMRA | Invitrogen | C34551 |
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 1600-069 | |
| 趋化实验 | CCL2趋化因子 | R&D Systems | 279-MC-010 |
| CXCL10趋化因子 | R&D Systems | 266-IP-010 | |
| CXCL12趋化因子 | R&D Systems | 350-NS-010/CF | |
| 流式细胞术 | 抗人CD45抗体 | STEMCELL Technologies | 60018 |
| 抗人CD14抗体 | STEMCELL Technologies | 60004 | |
| 抗人CD3抗体 | STEMCELL Technologies | 60011 | |
| 抗人CD19抗体 | STEMCELL Technologies | 60005 | |
| Aβ检测 | V-PLEX Aβ肽段检测试剂盒1（6E10） | Meso Scale Diagnostics LLC | K15200E-2 |
| 细胞分离 | EasySep直接人免疫分离试剂盒 - T细胞 | STEMCELL Technologies | 19661 |
| EasySep直接人免疫分离试剂盒 - CD4+ T细胞 | STEMCELL Technologies | 19662 | |
| EasySep直接人免疫分离试剂盒 - CD8+ T细胞 | STEMCELL Technologies | 19663 | |
| EasySep直接人免疫分离试剂盒 - 单核细胞 | STEMCELL Technologies | 19669 | |
| EasySep直接人免疫分离试剂盒 - B细胞 | STEMCELL Technologies | 19674 | |
| 细胞因子检测 | 人Kiloplex定量蛋白质组学阵列 | Ray-Biotech | QAH-CAA-X00-1 |
| 免疫染色 | 抗p-tau抗体（AT8） | Thermo Scientific | MN1020 |
| 抗GFAP抗体 | Neuromab | 75-240 | |
| 抗Tuj1抗体 | Cell Signaling Technology | 5568 | |
| 抗IBA1抗体 | Millipore Sigma | MABN92 | |
| 抗CD11b抗体 | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| 小鼠脑免疫染色 | CD45-FITC抗体 | BioLegend | 103107 |
| 抗小鼠CD45.2抗体 | BioLegend | 109807 | |
| 抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101225 | |
| 抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100421 | |
| 抗小鼠CD8α抗体 | BioLegend | 100733 | |
| LIVE/DEAD可固定黄色死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34959 | |
| CD8α抗体（D4W2Z） | Cell Signaling | 98941 | |
| CXCR3抗体 | Santa Cruz | sc-137140 | |
| CXCL10抗体 | R&D Systems | AF-466-NA | |
| GFAP抗体 | Millipore Sigma | G6171 | |
| 3D6抗体 | E. Lilly | -- | |
| 免疫染色 | 赫斯特染料 | Thermo Fisher Scientific | 62249 |
| 神经损伤定量 | Tuj1抗体 | abcam | ab24629 |
| MAP2抗体 | Cell Signaling Technology | 4542 | |
| ALDH1L1抗体 | EMD Millipore | MABN495 | |
| 趋化实验 | MAB160中和抗体 | R&D Systems | MAB160-100 |
| NBI74330拮抗剂 | R&D Systems | 4528/10 | |
| 流式细胞术 | 抗人CXCR3 PE抗体 | BioLegend | 353706 |
| 抗人CD3 APC抗体 | BioLegend | 317318 | |
| 抗人CD45-FITC抗体 | BioLegend | 982316 | |
| 人TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| 抗人Alexa Fluor 647 CD4+抗体 | BioLegend | 344636 | |
| 抗人Brilliant Violet CD8+抗体 | BioLegend | 344748 | |
| 细胞因子检测 | MSD U-PLEX定制免疫肿瘤学第1组（人）检测 | Meso Scale Diagnostics | K151AEM-2 |
| 钙成像 | Cal-590 AM | AAT Bioquest | -- |
| 细胞染色 | CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D神经免疫轴模型构建 | AD细胞系（ReN细胞含APP/PSEN1突变）、分化时间（4周）、iMGL加入时机（1天前）、PBMCs数量（5×10^4） 阅读提示：Methods: Neuroimmune axis model |
| PBMC分离和染色 | 分离试剂盒（EasySep）、染色剂（Hoechst或CMRA）、培养基（IMDM+20%FBS） 阅读提示：Methods: Isolation of human PBMCs |
| 趋化实验 | 趋化因子种类和浓度（CXCL12、CCL2、CXCL10）、细胞数量（5×10^4）、成像时间（15-20h） 阅读提示：Methods: Chemotaxis of human PBMCs |
| CD8+ T细胞浸润和神经损伤评估 | T细胞亚群（CD4+/CD8+）、微胶质存在与否、处理时间（72h）、损伤检测指标（GFP+面积、Tuj1等） 阅读提示：Results: Dramatically increased neurodegeneration...; Methods: Quantification of neurodegeneration |
| CXCL10-CXCR3阻断实验 | 中和抗体（MAB160, 10 μg/ml）或拮抗剂（NBI74330）、处理时间（40min）、T细胞数量（5×10^4） 阅读提示：Methods: Blocking CXCL10-CXCR3 axis |
| 5×FAD小鼠脑内浸润检测 | 小鼠品系（5×FAD和WT）、年龄（6-7月龄或7月龄）、CD45-FITC血管内染色、灌注、流式分析 阅读提示：Methods: Quantification of brain-localized T cells in 5×FAD mice |