验证mTORC2直接磷酸化Akt Ser473
排除Akt自磷酸化，确认mTORC2对Ser473的直接催化作用
使用催化失活Akt D274A、ATP竞争性Akt抑制剂GDC-0068和AZD5363、变构抑制剂MK-2206，以及Akt1/2双敲除HCT116细胞转染T443A或D274A进行Ser473磷酸化检测
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mTORC2招募和选择性磷酸化Akt的结构基础
Structural basis for the recruitment and selective phosphorylation of Akt by mTORC2.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、交联质谱、体外激酶动力学、细胞突变回补及整合建模等多层级验证
主要模型
SF9昆虫细胞表达的重组mTORC2 HEK293T细胞表达的重组mTORC2 Akt1/2双敲除HCT116细胞 mSin1敲除或Rictor敲除HEK293T细胞
重点核对
Akt-Torin双底物探针通过表达蛋白连接将Torin丙烯酰胺偶联至Akt C端肽Cys473，并与Akt(1–459)硫酯连接，形成全长Akt-Torin用于冷冻电镜 冷冻电镜分别解析apo mTORC2（整体分辨率3.12 Å）和mTORC2:Akt-Torin复合物（2.55 Å）结构 Akt N-lobe碱性斑块残基Lys158、Lys163、Lys182、Arg222及mSin1 CRIM酸性环（aa236–245）突变显著降低Akt Ser473和Thr450磷酸化 体外激酶反应条件：5 nM mTORC2、1 µM Akt、1 mM ATP、10 mM MgCl2、30°C反应10分钟 HCT116细胞转染Akt突变体后血清饥饿18–20小时，再用200 ng/mL胰岛素和60 ng/mL hIGF-1刺激40分钟检测pSer473
摘要
mTOR蛋白激酶形成两种多蛋白复合物mTORC1和mTORC2，它们在不同信号通路中发挥作用。mTORC1受营养物调控，mTORC2是磷酸肌醇3激酶（PI3K）和小GTP酶Ras信号网络的中心节点，这些网络在癌症和糖尿病中常发生失调。尽管mTOR在体外可磷酸化许多底物，但在细胞中mTORC1和mTORC2具有高度特异性：mTORC2磷酸化蛋白激酶Akt和PKC，而不磷酸化作为mTORC1底物的近缘激酶。为理解mTORC2如何识别底物，我们制备了半合成探针以捕获mTORC2-Akt复合物并解析其结构。大多数蛋白激酶识别磷酸化位点邻近的氨基酸，而局部序列对mTORC2的底物识别贡献很小。相反，特异性决定因素是Akt的二级和三级结构元件，其结合mTORC2组分mSin1上远离mTOR活性位点的区域，并在至少18种相关底物中保守。这些结果揭示了mTORC2如何识别其经典底物，并可能有助于设计mTORC2特异性抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mTORC2如何识别其经典底物Akt及AGC家族激酶并实现对Ser473等位点的选择性磷酸化？
- 核心机制
- mTORC2通过mSin1 CRIM结构域与Akt N-lobe碱性表面、mSin1 N-mooring与Akt C-lobe的长距离双界面相互作用识别Akt的三维结构，而非局部线性序列；Akt C-tail随后进入mTOR活性位点被直接磷酸化。
- 主要证据
- 利用Akt-Torin双底物探针捕获复合物，冷冻电镜解析mTORC2:Akt结构（2.55 Å），交联质谱验证界面，细胞突变回补和体外激酶实验证明CRIM及N-mooring界面残基对Ser473/Thr450磷酸化的必要性。
- 研究意义
- 阐明了mTORC2识别底物的结构机制，并可能为设计mTORC2特异性抑制剂以及广谱PIKK抑制剂提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析Akt局部序列对mTORC2磷酸化的贡献
检验Ser473邻近残基是否决定mTORC2底物识别
构建Akt F472A、pTyr474、pSer477、pSer479等突变体，进行体外磷酸化及定量western blot，并用nano-LC-MS/MS鉴定磷酸化位点
制备双底物探针并捕获mTORC2-Akt复合物
提高mTORC2与Akt的亲和力以解析复合物结构
通过表达蛋白连接制备Akt-ATP和Akt-Torin双底物类似物，测试其对mTORC2的抑制活性，并用尺寸排阻色谱分离复合物
冷冻电镜解析mTORC2及mTORC2:Akt-Torin结构
获得mTORC2与Akt相互作用的结构信息
对apo mTORC2和mTORC2:Akt-Torin进行单颗粒冷冻电镜数据采集、三维重建和原子模型搭建
验证Interface 1：Akt N-lobe–mSin1 CRIM
检验Akt N-lobe碱性斑块与mSin1 CRIM酸性环在底物识别中的作用
在Akt1/2-null HCT116中转染Akt碱性斑块单突变、双突变和四突变体，在mSin1-null HEK293T中用mSin1突变体回补，并进行体外激酶实验
验证Interface 2：Akt C-lobe–mSin1 N-mooring
检验mSin1 N端区域与Akt C-lobe的柔性对接界面
突变Akt residues 366–368、mSin1 Trp76/Phe78、Arg81–83，删除mSin1 50–76并替换为GGGGS linker，在细胞和体外检测磷酸化
交联质谱与整合建模
验证冷冻电镜界面并描述动态复合物结构
对mTORC2:Akt-Torin和mTORC2:Akt-ATP进行DSS或EDC/sulfo-NHS交联和质谱分析，基于冷冻电镜和交联数据用IMP进行整合建模
验证膜招募对mTORC2磷酸化Akt的影响
检验PIP3和PH结构域对mTORC2催化Akt Ser473的促进作用
制备对照和含PIP3的小单层囊泡，进行体外囊泡激酶实验；在mSin1-null HEK293T中用ΔPH-mSin1回补检测Akt磷酸化
验证mTORC2对PKCα和PKN1的类似识别机制
检验mTORC2识别机制是否适用于其他AGC家族激酶
在HCT116或HEK293T细胞中转染PKCα、PKN1突变体，用Torin1处理或mSin1突变体回补，检测疏水基序和turn motif磷酸化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Cellfectin II转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ExpiFectamine SF转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PEI MAX 40K转染试剂 | Polysciences | -- | |
| FreeStyle 293培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SF-900培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Grace昆虫培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ExpiSF CD培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads M-270环氧磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 交联质谱 | 辛二酸二琥珀酰亚胺酯 | ProteoChem | -- |
| 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| N-羟基硫代琥珀酰亚胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质检测 | 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- |
| 蛋白质纯化 | InstantBlue考马斯蛋白染色液 | Abcam | -- |
| TSKgel G4000SWXL凝胶过滤柱 | Tosoh | -- | |
| Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 镍-次氮基三乙酸琼脂糖 | MCLAB | -- | |
| Flag M2树脂 | -- | -- | |
| Western blot | Akt pSer473兔单克隆抗体 | Abcam | ab81283 |
| 总PKCα兔单克隆抗体 | Abcam | ab32376 | |
| mTOR兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| Rictor兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9476 | |
| mLST8兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3274 | |
| 总Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4685 | |
| Akt pThr450抗体 | Cell Signaling Technology | 12178 | |
| 总4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644 | |
| 4E-BP1 pT37/T46抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| PKCα pT638抗体 | Cell Signaling Technology | 9375 | |
| PKCα pS665抗体 | Cell Signaling Technology | 9371 | |
| Flag表位标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| HA表位标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 免疫沉淀 | Flag-M2抗体 | Millipore Sigma | F1804 |
| Western blot | 抗Raptor抗体 | EMD Millipore | 09–217 |
| 抗腺苷抗体 | LSBio | LS-C347801 | |
| 小鼠单克隆抗vinculin抗体 | Santa Cruz | sc-73614 | |
| 小鼠单克隆抗mSin1抗体 | Sigma | 05–1044 | |
| 兔多克隆抗mSin1抗体 | Bethyl | A300–910A | |
| 体外激酶实验 | Torin1 | -- | -- |
| Torin2 | -- | -- | |
| 细胞处理 | GDC-0068 | -- | -- |
| AZD5363 | -- | -- | |
| MK-2206 | -- | -- | |
| 囊泡制备 | 18:1 (Δ9-顺式) PC (DOPC) | Avanti Polar Lipids | -- |
| 18:1 (Δ9-顺式) PE (DOPE) | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 18:1 PS (DOPS) | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 18:1 PI(3,4,5)P3 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 冷冻电镜样品制备 | Quantifoil R 1.2/1.3多孔碳膜铜网 | Quantifoil | -- |
| 冷冻电镜 | Titan Krios电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Gatan K3直接电子探测相机 | Gatan | -- | |
| BioQuantum能量过滤器 | Gatan | -- | |
| 质谱 | timsTOF Pro2质谱仪 | Bruker | -- |
| 7600 ZenoTOF质谱仪 | ABSciex | -- | |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 多肽合成 | Prelude自动合成仪 | Protein Technologies | -- |
| 蛋白质纯化 | Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- |
| TSKgel UP-SW Aggregate色谱柱 | Tosoh | -- | |
| TSKgel G4000SWXL色谱柱 | Tosoh | -- | |
| 100k离心浓缩装置 | Millipore Sigma | -- | |
| DNA转染 | PEI-MAX 40k转染试剂 | Polysciences | -- |
| 细胞裂解 | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | -- |
| CHAPS裂解液 | -- | -- | |
| 磷酸化检测 | λ蛋白磷酸酶 | New England Biolabs | -- |
| 质谱 | 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | -- |
| S-Trap微量柱 | ProtiFi | -- | |
| PTMScan磷酸化富集IMAC Fe-NTA磁珠 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 多肽合成 | ATP-γ-S锂盐 | Roche | -- |
| 化合物合成 | AMG-510 (Sotorasib) | MedChemExpress | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外mTORC2激酶实验 | mTORC2浓度5 nM、Akt浓度1 µM、ATP 1 mM、MgCl2 10 mM、30°C反应10分钟；底物和标准品浓度需校准 阅读提示：Methods“In Vitro Akt Phosphorylation Assay with mTORC2 and mTORC1” |
| 细胞转染与刺激 | Akt1/2-null HCT116细胞每孔50万、转染1.5 µg质粒、血清饥饿18–20小时、200 ng/mL胰岛素和60 ng/mL hIGF-1刺激40分钟 阅读提示：Methods“Akt and PKC Cell Signaling Assay in HCT116 cells” |
| 冷冻电镜样品制备 | mTORC2浓度0.6–1.0 µM、Akt-Torin摩尔比、Vitrobot Mark IV参数（blot 3秒、90%湿度）、金网型号Quantifoil R 1.2/1.3 阅读提示：Methods“mTORC2 and mTORC2-Akt Co-Complex Preparation for Cryo-EM”及Table S1 |
| 交联质谱 | DSS浓度0.5–5 mM处理25分钟或EDC 5–30 mM加2.5倍sulfo-NHS处理60分钟、23°C、1000 rpm；仅分析最低有效交联浓度 阅读提示：Methods“Protein Cross-linking and Mass Spectrometry (XL-MS)”及Figure S30 |
| 囊泡激酶实验 | 囊泡总脂1 mM、mTORC2 5 nM、Akt 0.2/1/5 µM、30°C预孵育1小时后加ATP反应10分钟；PIP3囊泡组成PC:PE:PS:PIP3 30:50:19:1 阅读提示：Methods“In Vitro Akt Phosphorylation Assay with mTORC2 and mTORC1”及Figure 5D图注 |