OIR模型中Adora2a表达分析
验证Adora2a在病理性视网膜血管生成中的表达变化
使用实时PCR和免疫荧光分析OIR小鼠视网膜中腺苷受体表达及Adora2a定位
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
内皮腺苷A2a受体介导的糖酵解对病理性视网膜血管生成至关重要
Endothelial adenosine A2a receptor-mediated glycolysis is essential for pathological retinal angiogenesis.
实验完整度
高包含OIR小鼠模型、内皮特异性基因敲除、HRMECs体外功能与机制验证、患者样本关联分析
主要模型
小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型 人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs） 内皮细胞特异性Adora2a敲除小鼠（Adora2aVEC-KO）
重点核对
OIR模型：P7-P12暴露于70%或75% O2，P12返回室内空气，P17检测 内皮特异性Adora2a敲除：Adora2aflox/flox与Cdh5-Cre杂交 HRMECs缺氧处理：0.5% O2或0.1-2% O2 腺苷处理浓度：20-100 µM，在10 µM EHNA存在下 ADORA2A敲低：30 nM siRNA
摘要
腺苷/腺苷受体介导的信号传导与多种缺血性疾病（包括缺血性视网膜病变）的发展有关。在此，我们展示腺苷A2a受体（ADORA2A）促进缺氧诱导转录因子-1（HIF-1）依赖的内皮细胞糖酵解，这对增殖性视网膜病变中的病理性血管生成至关重要。在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠的视网膜中，Adora2a表达显著增加。内皮细胞特异性而非巨噬细胞特异性的Adora2a缺失会降低关键糖酵解酶并减少OIR小鼠的病理性新生血管形成。在人原代视网膜微血管内皮细胞中，缺氧通过激活HIF-2α诱导ADORA2A表达。ADORA2A敲低会降低缺氧诱导的糖酵解酶表达、糖酵解通量以及内皮细胞增殖、出芽和管腔形成。机制上，ADORA2A激活通过ERK和Akt依赖的HIF-1α蛋白翻译激活促进糖酵解酶的转录诱导。综上所述，这些发现推进了ADORA2A作为增殖性视网膜病变和其他依赖病理性血管生成疾病治疗靶点的转化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 视网膜内皮腺苷-Adora2a信号是否在糖酵解和病理性视网膜血管生成中发挥作用。
- 核心机制
- 缺氧通过HIF-2α上调内皮ADORA2A，ADORA2A激活通过ERK和Akt依赖的翻译机制促进HIF-1α蛋白积累，进而上调糖酵解酶和内皮糖酵解，驱动血管生成。
- 主要证据
- OIR小鼠模型显示Adora2a表达增加且内皮特异性缺失减少病理性新生血管；HRMECs中ADORA2A敲低降低糖酵解和血管生成功能；机制实验证明ADORA2A通过ERK/Akt/HIF-1α通路调控糖酵解。
- 研究意义
- 推进ADORA2A作为增殖性视网膜病变和其他依赖病理性血管生成疾病的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
内皮特异性Adora2a敲除对病理性新生血管的影响
验证内皮Adora2a在病理性血管生成中的因果作用
构建Adora2aVEC-KO和Adora2aMφ-KO小鼠，进行OIR模型，评估无血管区和病理性新生血管
缺氧对HRMECs中ADORA2A表达的调控
验证缺氧是否通过HIF-2α上调ADORA2A表达
HRMECs暴露于缺氧，使用腺病毒过表达突变HIF-1α/HIF-2α或siRNA敲低HIF-1α/HIF-2α，检测ADORA2A表达
ADORA2A对HRMECs增殖和出芽的影响
验证ADORA2A对血管生成功能的影响
使用BrdU掺入、Ki-67染色、WST-1增殖实验和三维球体出芽实验检测ADORA2A敲低或过表达对HRMEC增殖和出芽的影响
ADORA2A对HRMECs糖酵解的调控
验证ADORA2A是否调控内皮细胞糖酵解
检测糖酵解基因表达、乳酸分泌和ECAR，使用Seahorse Flux分析
糖酵解在ADORA2A介导的血管生成中的作用
验证糖酵解是否介导ADORA2A的促血管生成效应
使用糖酵解抑制剂3PO或2-DG处理ADORA2A过表达或激活的HRMECs，检测增殖和出芽
ADORA2A调控HIF-1α蛋白翻译的机制
验证ADORA2A是否通过ERK/Akt通路调控HIF-1α翻译
使用MG132和CHx分析HIF-1α合成和降解，检测ERK/Akt/p70S6K/eIF-4E磷酸化，使用U0126和LY294002抑制
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 血管细胞基础培养基 | ATCC | -- |
| 微血管内皮细胞生长试剂盒-BBE | ATCC | -- | |
| 完全人内皮细胞培养基 | Cell Biologics | -- | |
| 腺病毒转导 | 表达人ADORA2A的腺病毒 | -- | -- |
| RNA干扰 | 腺苷A2A受体siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-39850 |
| 对照siRNA-A | Santa Cruz Biotechnology | sc-37007 | |
| HIF-1α siRNA | Dharmacon | L-004018 | |
| HIF-2α siRNA | Dharmacon | L-004814 | |
| 免疫荧光 | Adora2a抗体 | Millipore | 05-717 |
| IBA1抗体 | Sakura Finetek | 019-19741 | |
| 异凝集素B4 | Invitrogen | 121411 | |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| HIF-1α抗体 | BD Biosciences | 610958 | |
| Ki-67抗体 | Thermo Scientific | RM-9106 | |
| PFKFB3抗体 | Proteintech | 13763-1-AP | |
| CD31抗体 | Invitrogen | DIA-310 | |
| ERG抗体 | Abcam | EPR3864 | |
| Western blot | ADORA2A抗体 | Sigma | A-269 |
| HIF-1α抗体 | BD Biosciences | 610958 | |
| HIF-1α抗体 | R&D Systems | AF1935 | |
| HIF-2α抗体 | Novus Biologicals | NB100-122 | |
| PFKFB3抗体 | Proteintech | 13763-1-AP | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 磷酸化JNK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| JNK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 磷酸化p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 磷酸化eIF-4E抗体 | Cell Signaling Technology | 9741 | |
| eIF-4E抗体 | Cell Signaling Technology | 2067 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK064 |
| 增殖实验 | WST-1实验 | Sigma-Aldrich | 5015944001 |
| BrdU掺入 | BrdU标记试剂 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光 | 抗BrdU抗体 | Invitrogen | 03-3900 |
| 细胞培养 | 1型胶原蛋白（大鼠尾） | BD Biosciences | -- |
| 基质胶 | BD Bioscience | -- | |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 腺苷 | Sigma-Aldrich | -- |
| EHNA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 3PO | Merck Millipore | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Merck Millipore | -- | |
| DAPT | Merck Millipore | -- | |
| Western blot | MG132 | -- | -- |
| U0126 | -- | -- | |
| LY294002 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | DRAQ5 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞培养 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | -- |
| 实时PCR | Power SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- |
| QuantiTect逆转录试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa488或Alexa-594标记的西非单籽豆凝集素B4 | Invitrogen | 121411 and 121413 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OIR模型构建 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（包括雄性和雌性）、O2浓度（70%或75%）、暴露时间（P7-P12）、返回室内空气时间（P12）、检测时间点（P17）、排除标准（体重小于6g） 阅读提示：Methods中的“Mouse model of OIR”小节 |
| 内皮特异性Adora2a敲除小鼠 | Adora2aflox/flox与Cdh5-Cre或Lysm-Cre杂交，遗传背景（C57BL/6J） 阅读提示：Methods中的“Mouse generation and breeding”小节 |
| HRMECs缺氧处理 | 缺氧浓度（0.5% O2或0.1-2% O2）、处理时间（6小时或指定时间） 阅读提示：Methods中的“Cell culture and treatments”小节及图注 |
| 腺苷处理 | 腺苷浓度（20-100 µM）、EHNA浓度（10 µM） 阅读提示：Methods中的“Cell culture and treatments”小节 |
| 腺病毒转导 | 感染复数（10 pfu/细胞）、腺病毒类型（Ad-A2AR, Ad-mutHIF-1α, Ad-mutHIF-2α, Ad-Ctrl） 阅读提示：Methods中的“Adenoviral transduction of HRMECs”小节 |
| RNA干扰 | siRNA浓度（30 nM）、靶基因（ADORA2A, HIF-1α, HIF-2α）、转染试剂 阅读提示：Methods中的“RNA interference”小节 |
| 球体出芽实验 | 细胞数（750细胞/球体）、培养基（25% VCBM）、甲基纤维素浓度（0.25%）、胶原浓度（1.5 mg/ml）、检测时间（24小时） 阅读提示：Methods中的“Spheroid capillary sprouting assay”小节 |
| 代谢测量 | 细胞数（1.5×10^4/孔）、Seahorse XF96板、抑制剂浓度（葡萄糖10 mM，寡霉素2 µM，2-DG 50 mM，FCCP 1 µM，抗霉素A 0.5 µM，鱼藤酮0.5 µM） 阅读提示：Methods中的“Metabolic measurements”小节 |