全基因组RNAi筛选鉴定NOD2负调控因子
筛选负向调控NOD2诱导NF-κB活化的基因。
在稳定表达NOD2和NF-κB-GFP报告基因的HEK293T细胞中进行全基因组RNAi筛选，MDP刺激后检测GFP阳性细胞比例，并进行TLR3通路反筛和RIP2上下游定位分析。
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E3泛素连接酶ZNRF4负向调控NOD2信号并诱导MDP耐受
E3 Ubiquitin ligase ZNRF4 negatively regulates NOD2 signalling and induces tolerance to MDP.
实验完整度
高全基因组RNAi筛选、多种细胞模型、体外泛素化、小鼠体内敲低及细菌感染模型，含功能与机制验证
主要模型
HEK293T-NOD2-NF-κB-GFP报告细胞系 人原代CD14+单核细胞及巨噬细胞 HCT116肠上皮细胞系 C57BL/6J小鼠MDP耐受模型
重点核对
RNAi筛选：384孔板、50 nM siRNA、转染48 h、MDP 10 μg/ml刺激24 h、Z-score ±2.5判定 hits MDP耐受诱导：THP-1预刺激100 μg/ml 4 h，再刺激100 μg/ml 1–8 h；原代CD14+单核细胞预刺激10 μg/ml 24 h，再刺激100 μg/ml 6或1 h 小鼠MDP耐受：C57BL/6J腹腔注射MDP 35 mg/kg，6 h后二次注射，二次注射后3 h收集腹腔巨噬细胞 Znrf4体内敲低：vMO 12.5 mg/kg静脉注射连续3天，第4天MDP处理 细菌感染：L. monocytogenes MOI=1（离体）或4×10^4/鼠（体内），感染后24 h测CFU
摘要
先天免疫受体核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（NOD2）的适度调控对于控制细菌感染和炎症性疾病至关重要。慢性NOD2刺激会诱导对再刺激的无反应性，称为NOD2诱导的耐受。尽管有报道称NOD2衔接蛋白RIP2的水平可调控急性和慢性NOD2信号，但RIP2水平如何被调节尚不清楚。本研究表明ZNRF4诱导RIP2的K48连接泛素化并促进RIP2降解。一部分RIP2定位于内质网（ER），在未刺激和胞壁酰二肽刺激条件下均与ZNRF4相互作用。Znrf4敲低的单核细胞具有持续的核因子κB（NF-κB）活化，Znrf4敲低小鼠的NOD2诱导耐受降低，对单核细胞增生李斯特菌感染的控制更有效。因此，我们的结果证明E3泛素连接酶ZNRF4介导的RIP2降解是NOD2诱导的NF-κB、细胞因子和抗菌反应在体外和体内的负调控机制，并确定了ZNRF4-RIP2轴精细调节NOD2信号以促进保护性宿主免疫。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NOD2信号在急性和慢性刺激下如何被负向调控，以及MDP诱导耐受的分子机制是什么。
- 核心机制
- E3泛素连接酶ZNRF4与RIP2的CARD结构域相互作用，催化RIP2第503位赖氨酸K48连接泛素化，促进蛋白酶体依赖性RIP2降解，从而负向调控NOD2-NF-κB信号并诱导MDP耐受。
- 主要证据
- 全基因组RNAi筛选鉴定ZNRF4为NOD2负调控因子；体外泛素化实验证实ZNRF4介导RIP2 K48泛素化；细胞实验显示ZNRF4敲低增强NF-κB活化和细胞因子分泌；小鼠体内Znrf4敲低消除NOD2耐受并增强对L. monocytogenes的控制。
- 研究意义
- 揭示了ZNRF4-RIP2轴精细调控NOD2信号以维持免疫稳态的机制，为理解NOD2信号负调控和耐受诱导提供新见解，并可能有助于解释先天免疫耐受个体对继发细菌感染的易感性及开发调控NOD2信号的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ZNRF4对NOD2信号的负调控作用
验证ZNRF4敲低或过表达对NOD2诱导NF-κB活化和细胞因子分泌的影响。
在HEK293T-NOD2、人原代CD14+单核细胞、HCT116细胞中敲低或过表达ZNRF4，检测NF-κB荧光素酶活性、p-IκBα、MAPK磷酸化及IL-8、TNF、IL-1β分泌。
验证ZNRF4与RIP2的相互作用及降解机制
确定ZNRF4是否通过泛素化降解RIP2负调控NOD2信号。
共免疫沉淀检测ZNRF4与RIP2相互作用及结构域；免疫印迹检测RIP2降解；体外泛素化实验检测K48连接泛素化；质谱鉴定RIP2泛素化位点K503；MG132和CHX实验验证蛋白酶体依赖性。
验证ZNRF4与RIP2在内质网的共定位
确定ZNRF4与RIP2相互作用的亚细胞定位。
HCT116细胞亚细胞组分分离和共聚焦显微镜检测RIP2与ZNRF4在内质网的共定位。
验证ZNRF4介导的RIP2降解在MDP耐受中的作用
确定ZNRF4是否通过降解RIP2诱导NOD2耐受。
在THP-1细胞、人原代CD14+单核细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中诱导MDP耐受，检测ZNRF4敲低对RIP2水平、p-IκBα和细胞因子产生的影响。
体内验证Znrf4敲低对NOD2耐受和细菌感染控制的影响
在体内验证ZNRF4对NOD2耐受及抗菌免疫的调控作用。
使用vivo-morpholino敲低小鼠Znrf4，诱导MDP耐受后检测腹腔巨噬细胞和肠上皮细胞中RIP2、p-IκBα水平，离体和体内感染L. monocytogenes后检测细菌载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选与鉴定调控因子
验证分子表达与相互作用
评估细胞功能与免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| MDP刺激 | 胞壁酰二肽 | Invivogen | tlrl-mdp |
| NOD1刺激 | iE-DAP | Invivogen | tlrl-dap |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Calbiochem | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| Dulbecco改进Eagle培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| siRNA转染 | DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon | T-2001-03 |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
| TransIT-TKO转染试剂 | Mirus | MIR 2150 | |
| 质粒转染 | Fugene转染试剂 | Roche | -- |
| 荧光素酶检测 | Dual-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | E2920 |
| 体外泛素化 | 体外泛素化试剂盒 | Enzo Lifesciences | BML-UW9920 |
| 体外泛素化试剂盒 | Boston Biochem | K-960 | |
| 免疫印迹 | 抗RIP2抗体（H-300） | Santa Cruz Biotechnology | sc-22763 |
| 抗RIP2抗体（A-10） | Santa Cruz Biotechnology | sc-166765 | |
| 抗ZNRF4抗体 | Abcam | ab173954 | |
| 抗ZNRF4抗体 | Abcam | ab67951 | |
| 抗ZNRF4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-169900 | |
| 抗磷酸化IκBα（Ser32）抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗磷酸化p44/p42 MAPK（ERK1/2）抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| 抗磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 | |
| 抗K48泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 4289 | |
| 抗K63泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 5621 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9482 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Santa Cruz Biotechnology | SC2002 |
| ELISA | IL-8 ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 550999 |
| TNF ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 550610 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| NF-κB p65活性检测 | NF-κB p65转录因子检测试剂盒 | Abcam | ab133112 |
| 质粒突变 | QuickChange II XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200521 |
| 小鼠体内敲低 | 靶向ZNRF4的体内吗啉代寡核苷酸 | Gene Tools, LLC | -- |
| 体内吗啉代寡核苷酸标准对照 | Gene Tools, LLC | -- | |
| 质谱分析 | Q Exactive串联质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Dionex Ultimate 3000 RSLCnano系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Dionex EASY-spray色谱柱（PepMap C18，3 μm，100 A，75 μm × 15 cm） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 荧光素酶报告基因 | NF-κB荧光素酶报告质粒 | Promega | E8491 |
| 海肾荧光素酶质粒 | Promega | E2241 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组RNAi筛选 | 细胞系（293T-NOD2-NF-κB-GFP）、siRNA浓度50 nM、转染时间48 h、MDP浓度10 μg/ml、刺激时间24 h、Z-score阈值±2.5、384孔板每孔6,000细胞 阅读提示：Methods 'RNAi screen methodology'小节及Figure 1图注 |
| MDP耐受诱导（细胞） | THP-1预刺激MDP 100 μg/ml 4 h，再刺激100 μg/ml 1–8 h；原代CD14+单核细胞预刺激10 μg/ml 24 h，再刺激100 μg/ml 6或1 h 阅读提示：Methods 'MDP tolerance induction'小节及Figure 7图注 |
| 小鼠MDP耐受诱导 | C57BL/6J小鼠7–12周龄、MDP 35 mg/kg腹腔注射、二次注射间隔6 h、二次后3 h收集腹腔巨噬细胞 阅读提示：Methods 'In vivo induction of MDP tolerance'小节及Figure 7图注 |
| Znrf4体内敲低 | vMO序列5′ CATGGCAGTCCCTACCTCCGGCTC-3′、剂量12.5 mg/kg静脉注射连续3天、第4天MDP处理 阅读提示：Methods 'Systemic knockdown of Znrf4 in mice'小节 |
| 细菌感染实验 | L. monocytogenes离体MOI=1、体内4×10^4/鼠腹腔注射、感染后24 h检测肝脏/脾脏CFU、庆大霉素100 μg/ml或50 μg/ml处理 阅读提示：Methods 'Cell culture and bacterial infection experiments'及'In vivo infection of mice with L. monocytogenes'小节 |