Eμ-Myc转基因结构与自发淋巴瘤基因组测序
全面刻画Eμ-Myc转基因结构及自发性淋巴瘤中的体细胞突变和结构改变
对自发性Eμ-Myc淋巴瘤#88及匹配种系尾组织DNA进行全基因组测序，并用pUC12载体序列增强参考基因组以定位转基因断点和拷贝数；对23例自发性Eμ-Myc淋巴瘤进行全外显子组测序，并以正常尾DNA过滤种系多态性
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Eμ-Myc小鼠淋巴瘤的基因组特征鉴定出Bcor是Myc协同作用的抑癌基因
Genomic characterisation of Eμ-Myc mouse lymphomas identifies Bcor as a Myc co-operative tumour-suppressor gene.
实验完整度
高包含全基因组/外显子组/RNA测序、shRNA与CRISPR-Cas9体内移植功能验证、免疫印迹及细胞竞争性增殖实验
主要模型
Eμ-Myc转基因小鼠自发性B细胞淋巴瘤 Eμ-Myc胎肝造血祖细胞移植模型 Eμ-Myc淋巴瘤细胞系#4242与#6066 人Namalwa Burkitt淋巴瘤细胞系
重点核对
Eμ-Myc淋巴瘤样本数量与来源：前瞻性16例加回顾性7例，共23例用于WES shRNA敲低Bcor（pLMS-Bcor.sh9）与Trp53及Scram对照，每队列n=13，尾静脉注射106个GFP阳性Eμ-Myc胎肝细胞 CRISPR-Cas9敲除Bcor（pCIG-BcorG2）与Trp53及Scram对照，每队列n=6，注射106个GFP阳性Eμ-Myc胎肝细胞 Bcor突变/敲低淋巴瘤RNA-seq分析：shBcor n=6、shp53 n=6、NrasQ61K n=5，差异基因筛选标准FDR校正<0.05且log2倍数变化≥2 靶向扩增子测序验证突变，变异检出流程特异性92.6%（75/81）
摘要
Eμ-Myc小鼠是广泛使用的MYC驱动恶性肿瘤模型；但迄今为止，对导致自发性淋巴瘤发生的MYC协同突变仅有部分特征描述。在此，我们对自发产生的Eμ-Myc淋巴瘤进行测序，以确定转基因结构、体细胞突变和结构改变。我们鉴定出PRC1样组分及BCL6共抑制因子基因Bcor中频繁出现的破坏性突变。此外，我们发现意外的多基因病变同时存在，涉及Cdkn2a缺失以及其他癌症基因，包括Nras、Kras和Bcor。这些发现挑战了Eμ-Myc淋巴瘤假定的两次打击模型，并证明Bcor在体内具有抑制肿瘤发生的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Eμ-Myc小鼠自发性淋巴瘤中除已知的Trp53、Cdkn2a和Nras病变外，还存在哪些与MYC协同的遗传病变，以及这些病变的功能作用如何。
- 核心机制
- Bcor作为抑癌基因抑制Myc驱动的淋巴瘤发生；Bcor功能缺失与MYC协同驱动淋巴瘤发生，其突变淋巴瘤呈现独特基因表达特征并提示TGFβ信号异常。
- 主要证据
- 对23例自发性Eμ-Myc淋巴瘤进行WES发现Bcor在7例（32%）中发生移码或 nonsense 突变；shRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除Bcor显著加速小鼠淋巴瘤发生；在Bcor突变#4242细胞和人Namalwa细胞中重新表达Bcor导致竞争性增殖劣势；RNA-seq显示Bcor失活淋巴瘤具有可重复的393基因表达特征并与TGFβ信号上调相关。
- 研究意义
- 研究挑战了Eμ-Myc淋巴瘤假定的两次打击模型，首次通过体内功能实验证明Bcor可作为抑癌基因，并为MYC与p19ARF在Eμ-Myc淋巴瘤发生中的功能相互作用提供信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
突变验证与克隆性分析
验证外显子组测序检出的体细胞突变并判断多驱动病变是否共存于同一肿瘤克隆
采用靶向扩增子大规模平行测序验证SNV和InDel，并对4周龄及疾病终末期外周血B细胞进行系列分析；对#6066和#4242细胞进行逆转录病毒条形码标记、单细胞分选和克隆扩增，以确认Cdkn2a与Bcor或Nras病变共存于同一细胞
Bcor抑癌功能的体内验证
通过体内功能实验验证Bcor是否抑制Myc诱导的淋巴瘤发生
在Eμ-Myc胎肝造血祖细胞中用shRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除Bcor，并以Trp53敲低/敲除及Scram对照比较；将转导细胞静脉注射入致死剂量照射的同基因C57BL/6小鼠，监测肿瘤潜伏期；用Western blot和RNA-seq确认Bcor蛋白缺失及 exon 4 的插入/缺失
Bcor缺失细胞中的再表达竞争实验
验证Bcor缺失是否赋予肿瘤细胞竞争优势
在Bcor突变#4242 Eμ-Myc淋巴瘤细胞和人Namalwa Burkitt淋巴瘤细胞中，用MSCV逆转录病毒重新表达野生型BCOR或空载体，与未转导亲本细胞按GFP阳性:阴性50:50混合，纵向监测GFP阳性群体比例，并用Western blot确认BCOR再表达
Bcor失活淋巴瘤的转录组与通路分析
解析Bcor失活与MYC协同的分子基础并判断不同方式Bcor失活是否产生一致表达特征
对shBcor、shp53、NrasQ61K过表达、CRISPR sgBcor及自发Bcor突变淋巴瘤进行RNA-seq，筛选差异表达基因并用393基因特征进行聚类；用PANTHER进行通路分析；同时分析淋巴瘤IgM/IgD表型与Bcor突变的关联
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA提取 | miRNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA完整性检测 | Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| 全基因组测序建库 | TruSeq化学试剂 | Illumina | -- |
| Nextera Mate Pair样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| 全基因组与转录组测序 | HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- |
| 全外显子组捕获 | Agilent全外显子捕获试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 全外显子组测序 | HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- |
| RNA-seq建库 | TruSeq样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 靶向扩增子测序 | Phusion高保真PCR预混液 | New England Biolabs | -- |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Fluidigm CS1和CS2引物 | Fluidigm | -- | |
| MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 逆转录病毒包装 | pAMPHO病毒包装载体 | ClonTech | -- |
| Western blot | 兔抗Bcor抗体 | -- | -- |
| 小鼠抗磷酸化p44/42 MAPK（Erk1/2）克隆E10抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| 兔抗磷酸化STAT5（Tyr694）克隆D47E7抗体 | Cell Signaling Technology | 4322 | |
| 兔抗STAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9363 | |
| 兔抗磷酸化JAK2（Tyr1007/1008）抗体 | Cell Signaling Technology | 3771 | |
| 兔抗JAK2克隆D2E12抗体 | Cell Signaling Technology | 3230 | |
| 兔抗磷酸化S6RP（Ser240/244）抗体 | Cell Signaling Technology | 2215 | |
| 小鼠抗α微管蛋白克隆DM1A抗体 | Merck Millipore | MABT205 | |
| 兔抗HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4874 | |
| 小鼠抗β肌动蛋白克隆AC-74抗体 | Sigma Aldrich | A2228 | |
| 多克隆兔抗小鼠HRP二抗 | Dako | P026002-2 | |
| 多克隆猪抗兔HRP二抗 | Dako | P039901-2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Eμ-Myc淋巴瘤样本收集与测序队列 | 淋巴瘤样本数量（前瞻性16例、回顾性7例）、小鼠年龄与性别（详见Supplementary Table 1）、种系对照样本（#88尾组织与ML62尾组织） 阅读提示：Methods的Eμ-Myc Lymphomas小节及Supplementary Table 1 |
| 全基因组与外显子组测序及变异检出 | WGS覆盖度1–30倍、WES平均深度110倍、变异检出方法组合（muTect加一种其他方法用于SNV，至少两种方法用于InDel）、靶向扩增子验证特异性92.6% 阅读提示：Methods的Whole-genome sequencing、Exome sequencing与Variant validation小节，Supplementary Data 7–9 |
| Bcor shRNA/CRISPR体内功能实验 | 每个队列样本量（shRNA n=13，CRISPR n=6）、注射细胞数106个GFP阳性胎肝细胞、对照序列（Scram、Trp53 shRNA/sgRNA）、注射途径与受体小鼠（致死剂量照射C57BL/6，静脉注射） 阅读提示：Methods的Viral transduction小节与Figure 4b, c图注 |
| Bcor再表达竞争性增殖实验 | 细胞系（#4242与Namalwa）、载体（MSCV-empty与MSCV-Bcor）、GFP阳性与阴性细胞50:50混合比例、BCOR再表达Western blot确认 阅读提示：Methods的Viral transduction小节与Figure 5图注 |
| Bcor失活淋巴瘤RNA-seq与表达特征分析 | 各组样本量（shBcor n=6、shp53 n=6、NrasQ61K n=5）、差异表达筛选阈值（FDR校正<0.05，log2倍数变化≥2）、聚类方法与通路分析工具 阅读提示：Methods的RNA sequencing and data analysis小节与Figure 6图注 |