单细胞转录组图谱构建
识别人类不同脂肪库中脂肪祖细胞的异质性和发育轨迹。
使用10x Genomics平台对来自皮下、内脏、锁骨上、肾周四个脂肪库的14株人类脂肪祖细胞在分化过程中五个时间点（T1-T5）进行单细胞RNA测序，共获得56,371个高质量细胞。
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在人棕色和白色脂肪库中，成脂细胞和SWAT细胞从共同祖细胞分离
Adipogenic and SWAT cells separate from a common progenitor in human brown and white adipose depots
实验完整度
高包含scRNA-seq轨迹分析、RNA FISH验证、Percoll分离后的功能实验（Seahorse代谢分析）、FACS单细胞克隆实验及体内数据集标签转移验证，形成多层级功能与机制验证。
主要模型
人类皮下白色脂肪祖细胞 人类内脏白色脂肪祖细胞 人类锁骨上棕色脂肪祖细胞 人类肾周棕色脂肪祖细胞
重点核对
分化时间点T1-T5 Percoll密度梯度离心（1.03, 1.02, 1.01 g/ml） FACS单细胞分选后克隆扩增 Seahorse细胞外通量分析（5,000细胞/孔，含NE、oligomycin、FCCP、rotenone/antimycin处理） RNA FISH（RNAscope探针）标记ADIPOQ、DCN等
摘要
脂肪细胞功能是代谢疾病的主要决定因素，因此有必要研究其调控机制。我们在单细胞分辨率下证明，来自四个人类棕色和白色脂肪库的祖细胞分化为两个主要细胞命运，即成脂分支和结构分支，它们从共同祖细胞发育而来。成脂基因特征包含线粒体活性基因，并与脂肪分布的基因组关联研究性状相关。基于细胞外基质和发育基因特征，我们将结构分支的细胞命名为结构Wnt调节的脂肪组织驻留（SWAT）细胞。当从成脂细胞中剥离后，SWAT细胞通过恢复至祖细胞状态或分化为新的成脂细胞而表现出多能表型，具体取决于培养基。标签转移算法在人类脂肪组织数据集中重现了这些细胞类型。总之，我们提供了人类脂肪细胞的分化图谱，并定义了多能SWAT细胞，为脂肪组织调控提供了新视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究人类不同脂肪库（棕色和白色脂肪组织）中脂肪细胞分化的细胞异质性与发育层级。
- 核心机制
- 人类脂肪祖细胞在分化早期从共同祖细胞分化为成脂细胞和SWAT细胞两个分支，SWAT细胞通过上调成骨转录因子网络（如SNAI2、JUNB）和Wnt信号通路（如TCF7L2）避免成脂分化，而PPARG、CEBPA等驱动成脂分化。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序（56,371个细胞）结合Monocle伪时间分析显示分化轨迹分支；RNA FISH验证了分支特异性转录因子和标记基因的表达分离；Percoll密度梯度分离后的细胞功能实验（Seahorse）表明成脂细胞具有更高线粒体呼吸能力；FACS单细胞克隆实验证实共同祖细胞可分化为两种细胞类型。
- 研究意义
- 本研究提供了人类脂肪细胞的分化图谱，定义了新的多能SWAT细胞，提示成脂与SWAT细胞的分支平衡可能影响脂肪组织功能和代谢疾病风险，为脂肪组织调控提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
伪时间轨迹分析
确定细胞分化路径和分支点。
使用Monocle工具对分化中的脂肪祖细胞进行伪时间排序，发现细胞从共同祖细胞（P分支）分化为上分支（U）和下分支（L）。并利用Velocyto验证轨迹。
分支特异性基因和转录因子鉴定
确定分支的分子特征和潜在调控因子。
使用BEAM分析鉴定分支依赖基因，并分析转录因子和分泌蛋白表达。发现上分支表达成脂基因（如ADIPOQ、PPARG、CEBPA），下分支表达细胞外基质基因（如DCN、MGP）和成骨相关转录因子（如SNAI2、JUNB）。
RNA FISH验证
验证单细胞数据预测的分支特异性标记在组织中的共定位情况。
利用RNAscope探针对分化第4天和第6天的人棕色脂肪细胞进行荧光原位杂交，确认成脂标记（如ADIPOQ）和SWAT标记（如DCN）在不同细胞中表达分离。
细胞分离和功能分析
评估成脂细胞和SWAT细胞的线粒体功能和代谢差异。
通过Percoll密度梯度离心将分化10天的细胞分离为成脂细胞（低密度）和SWAT细胞（高密度），并使用Seahorse细胞外通量分析测量氧气消耗率，发现成脂细胞基础和NE刺激的呼吸均显著高于SWAT细胞。
SWAT细胞多能性验证
探究SWAT细胞是否具有分化为成脂细胞或恢复为祖细胞的能力。
将Percoll分离的SWAT细胞分别培养在增殖培养基（PM）或分化培养基（DM）中，检测祖细胞标记的表达；然后诱导分化，评估成脂细胞形成。结果显示，在PM中培养的SWAT细胞部分恢复祖细胞特征，并能在后续分化中产生成脂细胞，且具有NE刺激的呼吸反应。
单细胞克隆实验
验证成脂细胞和SWAT细胞是否来源于共同祖细胞。
通过FACS分选单个脂肪祖细胞至96孔板，扩增后诱导分化，RNA FISH检测分化细胞中ADIPOQ和DCN表达，大多数克隆同时含有两种细胞类型，证实共同祖细胞的存在。
体内数据集验证
评估SWAT细胞和成脂细胞在人体脂肪组织中的存在。
使用Scanorama和scNym标签转移算法，将本研究数据与已发表的人类脂肪组织单细胞/单核RNA-seq数据集（Emont et al., Vijay et al., Sun et al.）进行映射，发现SWAT细胞与多个已注释的ASPC亚群对应。
遗传关联分析
评估成脂细胞和SWAT细胞与人类代谢性状的遗传关联。
使用CELLECT工具，将每个分支不同伪时间十分位数细胞的特异性表达与39个GWAS性状进行关联分析，发现成脂分支细胞与腰臀比（WHR）和低密度脂蛋白水平显著相关。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 11039047 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10270-106 | |
| 酸性成纤维细胞生长因子（FGF-1） | ImmunoTools | 11343557 | |
| TrypLE Express酶 | Gibco | 12605010 | |
| II型胶原酶 | Sigma | C6885-1G | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A8806-5G | |
| 分化诱导 | 地塞米松 | Sigma | D490 |
| Actrapid胰岛素 | Novo Nordisk | A10AB01 | |
| 罗格列酮 | Sigma | R2408 | |
| 异丁基甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma | I5879 | |
| 三碘甲状腺原氨酸（T3） | Sigma | T5516 | |
| 转铁蛋白 | Sigma | T8158 | |
| 细胞分离 | Percoll | Sigma | 4937 |
| RNA FISH | RNAscope多重荧光检测试剂盒v2 | ACDbio | 323110 |
| RNAscope 4-Plex辅助试剂盒 | ACDbio | 233120 | |
| Opal 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | |
| Opal 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | |
| Opal 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | |
| NucBlue ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
| 免疫荧光 | 抗perilipin抗体 | Cell Signaling | 9349S |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen | A21206 | |
| Hoechst 33342 | Abcam | ab228551 | |
| Triton X-100 | Sigma | 1003407653 | |
| 山羊血清 | Sigma | G9023 | |
| Seahorse分析 | Seahorse XF基础培养基 | Agilent Technologies | 102353-100 |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Mito StressTest试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| 大鼠胶原蛋白I | R&D systems | 3447-020-01 | |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | 15596026 |
| RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| RNA测序 | Universal Plus Total mRNA-Seq文库制备试剂盒（含NuQuant） | Tecan | 0520-A01 |
| 单细胞分选 | 7-AAD | BD Pharmingen | 59925 |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Primocin | InvivoGen | -- | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| FACS Melody细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3' v2试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 基因分型 | Infinium Global Screening Array-24 v1.0 | Illumina | -- |
| 细胞计数 | NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | -- |
| Solution 13 AO-DAPI | Chemometec | 910-3013 | |
| 成像 | EVOS成像系统 | Invitrogen | -- |
| Leica Thunder显微镜 | Leica | -- | |
| ImageXpress Pico显微镜 | Molecular Devices | -- | |
| BioTek Cytation 1 | BioTek | -- | |
| 测序 | NextSeq 500 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | Seurat | -- | -- |
| Monocle | -- | -- | |
| Velocyto | -- | -- | |
| Scellnetor | -- | -- | |
| BATLAS | -- | -- | |
| CELLECT | -- | -- | |
| Scanorama | -- | -- | |
| scNym | -- | -- | |
| Demuxlet | -- | -- | |
| GraphPad Prism | -- | -- | |
| Cell Ranger | -- | -- | |
| GenomeStudio | Illumina | -- | |
| PLINK | -- | -- | |
| Minimac3 | -- | -- | |
| Eagle v2.3 | -- | -- | |
| gProfileR | -- | -- | |
| REViGO | -- | -- | |
| GOplot | -- | -- | |
| Scanpy | -- | -- | |
| scikit-learn | -- | -- | |
| Python 3.10.6 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞来源（四位供体、四个脂肪库）、培养基成分（DMEM/F12、10% FBS、1%青霉素-链霉素、1 nM FGF-1）、培养条件（37°C、5% CO2）、细胞传代比例（1:3） 阅读提示：Methods - Cell culturing |
| 分化诱导 | 分化启动时机（融合后2天）、分化培养基成分（0.1 μM 地塞米松、100 nM Actrapid胰岛素、200 nM 罗格列酮、540 μM IBMX、2 nM T3、10 μg/ml 转铁蛋白）、分化时间（3天加IBMX+3天去IBMX、之后分化培养基2每3天更换） 阅读提示：Methods - Cell culturing |
| 单细胞RNA测序 | 在T1-T5时刻收集细胞、10x Genomics平台、读长（26/98/8循环）、参考基因组hg19、细胞过滤标准（线粒体基因<8%、基因数200-9000、UMI<120,000） 阅读提示：Methods - Single-cell library preparation and sequencing, Proliferating progenitor analysis |
| 轨迹分析 | Monocle版本（2.8.0）、特征选择（合并T1-T3和T4-T5子集聚类后差异表达，|logFC|>0.25）、DDRTree算法、BEAM分析（q值<0.05，|logFC|>0.3） 阅读提示：Methods - Monocle |
| RNA FISH | 固定时间（分化第4、6天）、固定液（10%中性缓冲福尔马林）、RNAscope试剂盒版本（Multiplex Fluorescent v2）、探针序列（见补充表13）、Opal染料（520、570、620、690）、成像系统（EVOS、Leica Thunder） 阅读提示：Methods - RNA FISH |
| Percoll分离 | 密度梯度（1.03、1.02、1.01 g/ml）、离心条件（30分钟、1000g、RT）、细胞浓度 阅读提示：Methods - Percoll density gradient separation |
| Seahorse分析 | 细胞接种密度（5,000细胞/孔）、预包被（大鼠胶原I，仅成脂细胞）、基础培养基（XF base含25 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸盐、2 mM Glutamax）、药物处理（10 μM NE、2 μM oligomycin、0.75 μM FCCP、0.75 μM rotenone/antimycin）、细胞计数归一化（Hoechst染色） 阅读提示：Methods - Seahorse experiments, Extracellular flux analysis |
| 细胞克隆实验 | FACS分选（FACS Melody）、单细胞接种（Matrigel包被96孔板）、培养条件（50%新鲜增殖培养基+50%条件培养基）、克隆扩增（70-90%融合传代）、分化诱导（融合后2天）、固定时间（分化第6天） 阅读提示：Methods - Clonal cell populations |