鉴定Sall1超级增强子
确定调控Sall1表达的顺式调控元件
通过ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq和p300 ChIP-seq鉴定Sall1超级增强子，并利用PLAC-seq确认其与Sall1启动子的互作。
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SALL1强制执行小胶质细胞特异性的SMADs DNA结合和功能，以建立小胶质细胞身份
SALL1 enforces microglia-specific DNA binding and function of SMADs to establish microglia identity
实验完整度
高包含Sall1增强子敲除小鼠、Smad4条件敲除小鼠、多种组学（ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq、Hi-C、PLAC-seq）及功能验证，多层级证据明确。
主要模型
小鼠小胶质细胞 Sall1增强子敲除（EKO）小鼠 Cx3cr1CreER×Smad4fl/fl（Smad4 cKO）小鼠
重点核对
Sall1增强子敲除导致小胶质细胞中Sall1表达完全丧失，其他脑细胞类型不受影响 SMAD4直接结合Sall1超级增强子，且Smad4缺失导致Sall1表达降低75% SALL1结合位点与SMAD4结合位点高度重叠（72%） SALL1缺失导致SMAD4在部分增强子结合减少，在另一部分增强子结合增加 Sall1单倍剂量不足（Het EKO）导致基因表达渐进性变化，与衰老和疾病相关
摘要
Spalt样转录因子1（SALL1）是器官发生和小胶质细胞身份的关键调控因子。在此，我们证明破坏与Sall1启动子相互作用的保守的小胶质细胞特异性超级增强子会导致小胶质细胞中Sall1表达的完全且特异性丧失。通过确定SALL1的基因组结合位点并利用Sall1增强子敲除小鼠，我们提供了SALL1与SMAD4之间功能相互作用的证据，这对小胶质细胞特异性基因表达是必需的。SMAD4直接结合Sall1超级增强子，并且是Sall1表达所必需的，这与TGFβ和SMAD同源物Dpp和Mad对果蝇翅膀中Spalt细胞特异性表达的进化保守需求一致。出乎意料的是，SALL1反过来促进SMAD4在小胶质细胞特异性增强子上的结合和功能，同时抑制SMAD4结合到在增强子敲除小胶质细胞中被不适当地激活的基因增强子上，从而强制执行TGFβ–SMAD信号轴的小胶质细胞特异性功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SALL1如何调控小胶质细胞特异性基因表达并建立小胶质细胞身份？
- 核心机制
- SALL1通过微胶质细胞特异性超级增强子被SMAD4激活，随后SALL1与SMAD4协同或拮抗地调控增强子活性，强制执行微胶质细胞特异性的TGFβ-SMAD信号功能。
- 主要证据
- 利用Sall1增强子敲除（EKO）小鼠和Smad4条件敲除小鼠，结合ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、Hi-C和PLAC-seq分析，发现SALL1和SMAD4在基因组上大量共结合，且SALL1可促进或抑制SMAD4的结合。
- 研究意义
- 揭示了SALL1与SMAD4的相互作用如何塑造TGFβ在小胶质细胞中的转录反应，为理解小胶质细胞身份建立和维持提供了机制，并可能有助于理解神经发育和神经退行性疾病中SALL1表达改变的影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生成Sall1增强子敲除小鼠
研究该增强子对Sall1表达和小胶质细胞功能的影响
利用CRISPR/Cas9删除13kb的超级增强子区域，生成EKO小鼠，并通过RNA-seq、H3K27ac ChIP-seq和免疫荧光验证Sall1表达的缺失。
分析EKO小鼠转录组变化
评估Sall1缺失对小胶质细胞基因表达的影响
通过RNA-seq比较WT、Het EKO和EKO小胶质细胞的转录组，鉴定差异表达基因，并与小胶质细胞特征基因及相关疾病基因集比较。
确定SALL1的基因组结合位点
定义SALL1直接结合的靶基因和调控元件
通过ChIP-seq确定SALL1在全基因组上的结合位点，并进行从头基序分析，结合遗传变异和机器学习模型揭示结合序列决定因素。
分析SALL1对染色质状态的影响
区分SALL1直接和间接的激活或抑制作用
在EKO小胶质细胞中分析ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq，结合SALL1结合位点，将差异增强子分类为直接/间接激活/抑制，并进行基序分析。
研究SMAD4与SALL1的功能关系
探究SMAD4是否调控Sall1表达以及SALL1是否影响SMAD4的结合和功能
生成Smad4条件敲除小鼠，分析其转录组；进行SMAD4 ChIP-seq，比较WT和EKO小胶质细胞中SMAD4结合差异，并分析与H3K27ac变化的关联。
整合多组学数据构建模型
提出SALL1和SMAD4相互作用调控小胶质细胞身份的模型
综合所有数据，提出SALL1和SMAD4协同或拮抗调控增强子活性的模型，并讨论其进化保守性和疾病相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠模型 | C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | stock |
| Cx3cr1CreER小鼠 | The Jackson Laboratory | stock | |
| Smad4fl/fl小鼠 | The Jackson Laboratory | stock | |
| 基因编辑 | Cas9蛋白 | NEB | M0646T |
| 基因分型 | KOD Xtreme热启动DNA聚合酶 | EMD Millipore | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD16/32封闭抗体 | BioLegend | 101319 |
| 抗CD11b-APC抗体 | BioLegend | 101212 | |
| 抗CD45-Alexa488抗体 | BioLegend | 103122 | |
| 抗CX3CR1-PE抗体 | BioLegend | 149006 | |
| Sony MA900 | Sony | -- | |
| MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫染色 | 抗SALL1抗体（克隆NRNSTNX） | Thermo Fisher | 14-9729-82 |
| 抗IBA1抗体 | FujiFilm | 019-19741 | |
| 驴抗大鼠555 | Invitrogen | SA5-10027 | |
| 驴抗兔488 | Invitrogen | R37118 | |
| Prolong Gold防淬灭剂 | Invitrogen | P36931 | |
| 尼康Sterling转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞核分选 | 抗PU.1-PE抗体 | Cell Signaling | 81886S |
| 抗OLIG2-AF488抗体 | Abcam | 225099 | |
| 抗SALL1-AF647抗体 | Thermo Fisher | 51-9279-82 | |
| 抗NEUN-AF488抗体 | Millipore | MAB377X | |
| ATAC-seq | Illumina标签化DNA缓冲液 | Illumina | 15027866 |
| DNA酶I | Illumina | 15027865 | |
| Zymo ChIP DNA浓缩柱 | Zymo Research | D5205 | |
| NEBNext高保真2x PCR预混液 | New England BioLabs | M0541 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | -- | |
| RNA-seq | TRIzol LS试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Direct-zol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R2052 | |
| Oligo d(T)磁珠 | NEB | S1419S | |
| RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| SpeedBeads磁珠 | GE Healthcare | -- | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| HiSeq 4000 | Illumina | -- | |
| ChIP-seq | Dynabeads蛋白A磁珠 | Invitrogen | -- |
| 抗H3K27ac抗体 | Active Motif | 39685 | |
| 抗SALL1抗体 | Abcam | ab41974 | |
| 抗SMAD4抗体 | Cell Signaling Technology | 46535 | |
| 抗p300抗体 | EMD Millipore | RW128 | |
| 抗p300抗体 | Diagenode | C15200211 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| Covaris E220超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| Hi-C | DpnII限制性内切酶 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系、年龄、性别；他莫昔芬处理剂量和时间 阅读提示：Methods: Mice, Tamoxifen-mediated deletion of Smad4 |
| Sall1增强子敲除小鼠生成 | CRISPR guide RNA序列、删除范围、基因分型引物 阅读提示：Methods: Generation of Sall1 EKO mouse |
| 小胶质细胞分选 | 抗体克隆和稀释度、分选门控（CD11b+CD45lowCX3CR1+）、固定条件 阅读提示：Methods: Flow cytometry to sort live microglia |
| RNA-seq | 样本量、RNA提取试剂盒、建库方法、测序平台、差异表达分析参数（DESeq2, p-adj<0.05, FC>2） 阅读提示：Methods: RNA-seq library preparation; Data mapping; RNA-seq analysis |
| ChIP-seq | 抗体、细胞数量、交联条件、超声参数、文库制备试剂盒、分析参数（IDR<0.05） 阅读提示：Methods: ChIP-seq library preparation; IDR analysis of ChIP and ATAC peaks |
| ATAC-seq | 细胞数量、转座酶反应条件、PCR循环数、测序平台 阅读提示：Methods: ATAC-seq library preparation |