鉴定PD-L1的N-糖基化及其位点
确定PD-L1是否存在N-糖基化以及具体的糖基化位点。
用PNGase F、Endo H和O-glycosidase处理细胞裂解物，Western blot检测PD-L1分子量变化；用LC-MS/MS鉴定糖肽；构建PD-L1 NQ突变体确定糖基化位点。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
程序性死亡配体-1的糖基化与稳定化抑制T细胞活性
Glycosylation and stabilization of programmed death ligand-1 suppresses T-cell activity.
实验完整度
高包含体外细胞模型、小鼠同系肿瘤模型和患者样本，并进行了功能验证（T细胞杀伤、IL-2表达）和机制验证（泛素化、磷酸化、糖基化位点突变）。
主要模型
人乳腺癌细胞系BT549、MDA-MB-231、MDA-MB-468 人胚胎肾细胞HEK 293T 小鼠乳腺癌细胞系4T1及4T1-Luc同系BALB/c小鼠模型 人乳腺癌患者组织样本
重点核对
PD-L1 N-糖基化位点：N35、N192、N200、N219的突变（NQ）对蛋白稳定性的影响 GSK3β对PD-L1的磷酸化位点：T180和S184的突变（3SA）对PD-L1降解和功能的影响 EGF处理浓度和时间：25 ng/ml EGF过夜处理对PD-L1表达的诱导 吉非替尼体内给药方案：10 mg/kg每日口服，每周5天，持续2周 抗PD-1抗体体内给药方案：100 μg腹腔注射，接种后第3、6、9、12天
摘要
程序性死亡配体-1（PD-L1）与程序性死亡蛋白-1（PD-1）之间的细胞外相互作用导致肿瘤相关免疫逃逸。本研究表明，PD-L1的免疫抑制活性受到泛素化和N-糖基化的严格调控。我们发现糖原合成酶激酶3β（GSK3β）与PD-L1相互作用，并通过β-TrCP诱导PD-L1的磷酸化依赖性蛋白酶体降解。对PD-L1 N192、N200和N219糖基化的深入分析表明，糖基化拮抗GSK3β结合。因此，只有非糖基化的PD-L1与GSK3β和β-TrCP形成复合物。我们还证明，在基底样乳腺癌中，表皮生长因子（EGF）通过失活GSK3β来稳定PD-L1。通过吉非替尼抑制EGF信号可 destabilize PD-L1，增强同系小鼠模型中的抗肿瘤T细胞免疫和PD-1阻断的治疗疗效。总之，我们的结果将泛素化和糖基化途径与PD-L1的严格调控联系起来，这可能带来增强癌症免疫治疗疗效的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PD-L1的糖基化和泛素化如何调控其蛋白稳定性，进而影响肿瘤免疫逃逸？
- 核心机制
- PD-L1的N-糖基化（N192、N200、N219）拮抗GSK3β结合，阻止GSK3β介导的磷酸化（T180、S184）和β-TrCP依赖的泛素化降解；EGF通过失活GSK3β稳定PD-L1。
- 主要证据
- 体外细胞实验证明非糖基化PD-L1与GSK3β结合并被磷酸化降解；糖基化位点突变（4NQ）或磷酸化位点突变（3SA）增加PD-L1稳定性；小鼠同系模型显示PD-L1 3SA促进肿瘤生长并减少CD8+ T细胞浸润；吉非替尼联合抗PD-1抗体增强抗肿瘤疗效。
- 研究意义
- 揭示了糖基化与磷酸化交互调控PD-L1泛素化和降解的新机制，靶向PD-L1稳定化（如EGFR抑制剂）可能增强PD-1阻断疗法的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证糖基化对PD-L1稳定性的影响
探究糖基化是否影响PD-L1蛋白稳定性及泛素化降解。
用CHX处理细胞检测PD-L1半衰期；用MG132处理检测泛素化；比较WT和NQ突变体的稳定性和泛素化水平。
验证GSK3β与PD-L1的相互作用及磷酸化
确定GSK3β是否结合并磷酸化非糖基化PD-L1，以及是否介导其降解。
GST pull-down、co-IP、Duolink assay检测相互作用；免疫复合物激酶实验检测磷酸化；用GSK3β CA、KD和β-TrCP过表达检测PD-L1降解和泛素化。
评估PD-L1磷酸化突变对T细胞免疫和肿瘤生长的影响
验证GSK3β介导的PD-L1降解是否影响PD-1结合、T细胞杀伤和体内肿瘤生长。
PD-1/Fc结合实验、T细胞介导的肿瘤细胞杀伤实验、4T1同系小鼠模型肿瘤生长和T细胞浸润分析。
验证EGF信号对PD-L1糖基化和稳定性的调控
确定EGF是否通过抑制GSK3β来稳定PD-L1。
用多种生长因子处理细胞，Western blot和流式检测PD-L1表达；用EGFR抑制剂处理；IHC分析人乳腺癌组织中p-EGFR、p-GSK3β、PD-L1和granzyme B的相关性。
评估吉非替尼联合抗PD-1抗体的体内疗效
验证抑制EGFR信号是否能增强PD-1阻断疗法的抗肿瘤效果。
在4T1-Luc同系小鼠模型中，单独或联合使用吉非替尼和抗PD-1抗体，监测肿瘤生长、生存期和T细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | -- |
| 转染 | 脂质体2000 | Life Technologies | -- |
| FuGENE 6转染试剂 | -- | -- | |
| 糖基化分析 | 肽N-糖苷酶F | New England BioLabs | -- |
| 内切糖苷酶H | New England BioLabs | -- | |
| O-糖苷酶 | New England BioLabs | -- | |
| 糖蛋白染色试剂盒 | Pierce/Thermo Scientific | -- | |
| 蛋白稳定性实验 | MG132 | -- | -- |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| Myc抗体 | Roche Diagnostics | 11667203001 | |
| HA抗体 | Roche Diagnostics | 11666606001 | |
| PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 13684 | |
| PD-L1抗体 | BioLegend | 329702 | |
| PD-L1抗体 | GeneTex | GTX117446 | |
| PD-L1抗体 | R&D Systems | AF156 | |
| PD-1抗体 | Abcam | ab52587 | |
| 颗粒酶B抗体 | Abcam | ab4059 | |
| EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 4267 | |
| GSK3β抗体 | Cell Signaling Technology | 9315 | |
| 磷酸化GSK3β Ser 9抗体 | Cell Signaling Technology | 9336 | |
| β-TrCP抗体 | Cell Signaling Technology | 4394 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | B-5-1-2 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| 药物处理 | 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | -- |
| 吉非替尼 | Calbiochem Corp | -- | |
| 厄洛替尼 | Calbiochem Corp | -- | |
| 拉帕替尼 | Calbiochem Corp | -- | |
| 西妥昔单抗 | Calbiochem Corp | -- | |
| AG1478 | Calbiochem Corp | -- | |
| 抗体生成 | 小鼠抗磷酸化PD-L1 T180抗体 | LifeTein | -- |
| 小鼠抗磷酸化PD-L1 S184抗体 | LifeTein | -- | |
| 免疫细胞化学 | 抗小鼠Alexa Fluor 488 | Life Technologies | -- |
| 抗兔Alexa Fluor 594 | Life Technologies | -- | |
| DAPI | Life Technologies | -- | |
| PD-1结合实验 | 重组人PD-1 Fc蛋白 | R&D Systems | -- |
| 抗人Alexa Fluor 488 | Life Technologies | -- | |
| T细胞杀伤实验 | caspase 3/7底物 | Essen Bioscience | -- |
| 抗CD3抗体 | -- | -- | |
| 白细胞介素-2 | -- | -- | |
| 共培养实验 | 人IL-2 ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| qRT-PCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| SuperScript III第一链cDNA合成系统 | Life Technologies | -- | |
| iQ5实时PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 动物实验 | Matrigel基底膜基质 | BD Biosciences | -- |
| 抗PD-1抗体（RMP1-14） | Bio X Cell | RMP1-14 | |
| 大鼠IgG | Bio X Cell | -- | |
| 肿瘤浸润淋巴细胞分析 | 胶原酶/透明质酸酶 | Stemcell Technologies | -- |
| DNA酶 | Sigma | -- | |
| Ficoll梯度 | Sigma | -- | |
| Dynabeads未接触小鼠T细胞试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | CD3-PerCP | BioLegend | -- |
| CD4-FITC | eBioscience | -- | |
| CD8-APC/Cy7 | BioLegend | -- | |
| CD45.1-PE | BioLegend | -- | |
| IFNγ-Pacific Blue | BioLegend | -- | |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Western blot成像 | Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| 糖基化检测 | IRDye 800CW 2-DG光学探针 | LI-COR Biosciences | -- |
| 免疫细胞化学 | 多光子共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| PD-1结合实验 | Synergy Neo酶标仪 | BioTeK | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 动态PD-1结合 | IncuCyte Zoom显微镜 | Essen Bioscience | -- |
| IHC | PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 13684 |
| 磷酸化EGFR（Y1068）抗体 | Cell Signaling Technology | 3777 | |
| 磷酸化GSK3β（S9）抗体 | Cell Signaling Technology | 9323 | |
| 颗粒酶B抗体 | Abcam | ab4059 | |
| N-糖肽鉴定 | 测序级胰蛋白酶 | -- | -- |
| ZipTip C18 | Millipore | -- | |
| Orbitrap Fusion三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| UltiMate 3000 RSLCnano系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap 100捕集柱 | Dionex | -- | |
| Acclaim PepMap RSLC分析柱 | Dionex | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PD-L1糖基化位点鉴定 | 糖基化位点突变体（N35Q、N192Q、N200Q、N219Q、4NQ）的构建和验证；PNGase F和Endo H处理条件；LC-MS/MS参数 阅读提示：Methods 'Glycosylation analysis of PD-L1'和'Identification of N-glycopeptide'，Figure 1d-h |
| PD-L1稳定性与泛素化实验 | CHX浓度（20 μM）和处理时间；MG132浓度；TM浓度；PD-L1 NQ突变体；泛素化检测用K48泛素抗体 阅读提示：Figure 2a-g，Methods 'Western blot analysis and immunoprecipitation' |
| GSK3β与PD-L1相互作用及磷酸化 | GSK3β CA（S9A）和KD（K85A）突变体；PD-L1磷酸化位点突变体（S176A、T180A、S184A、3SA）；抗磷酸化PD-L1 T180和S184抗体；λ-磷酸酶处理 阅读提示：Figure 3b-e，Supplementary Fig. 5-6，Methods 'Antibody generation' |
| T细胞杀伤和PD-1结合实验 | PD-L1 WT和3SA表达的BT549细胞；活化T细胞的比例和来源；共培养时间（96小时）；PD-1/Fc蛋白浓度；流式细胞术检测 阅读提示：Figure 3f-g，Methods 'PD-L1 and PD-1 interaction assay'和'T-cell-mediated tumour cell-killing assay' |
| 体内肿瘤模型和药物治疗 | 4T1或4T1-Luc细胞接种数量（5×10^4）和部位（乳腺脂肪垫）；Matrigel比例；吉非替尼剂量（10 mg/kg）和给药方案；抗PD-1抗体剂量（100 μg）和给药时间；小鼠品系（BALB/c）和性别周龄（6-8周雌性）；每组小鼠数量 阅读提示：Methods 'Animal treatment protocol'，Figure 3h，Figure 5f-j |
| EGF信号和EGFR抑制剂实验 | EGF浓度（25 ng/ml）和处理时间（过夜）；其他生长因子浓度；EGFR抑制剂浓度（1 μM）和处理时间（2小时预处理）；血清饥饿条件 阅读提示：Figure 4a-e，Figure 5a-b，Methods 'Antibodies and chemicals' |
| 人乳腺癌组织IHC | 抗体稀释比例（PD-L1 1:30，p-EGFR 1:200，p-GSK3β 1:200，Granzyme B 1:100）；染色评分标准；统计方法（Pearson χ2-test） 阅读提示：Methods 'IHC staining of human breast tumour tissue samples'，Supplementary Fig. 8c |