建立PTEN缺失人ESC与NSCs
获得同源PTEN缺失的人ESC和NSCs并确认其干细胞身份
用TALEN介导同源重组删除PTEN外显子1，PCR、Southern blot、免疫荧光和Western blot验证；将WT与PTEN−/− ESCs诱导为NSCs并检测神经前体标记及分化能力
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PTEN缺失将人神经干细胞重编程为胶质母细胞瘤干细胞样表型
PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype.
实验完整度
高含TALEN基因编辑细胞模型、体外功能验证、小鼠颅内移植瘤、GSC与患者数据集分析及药物筛选
主要模型
TALEN介导的PTEN敲除人ESC及其衍生NSCs PTEN敲除人ESC衍生的MSCs和成纤维样细胞 患者胶质母细胞瘤来源的GSCs NOD/SCID小鼠颅内移植模型
重点核对
PTEN敲除通过TALEN同源重组删除PTEN外显子1，经基因组PCR、Southern blot及Western blot验证 PTEN−/− NSCs经Transwell迁移、结晶紫克隆形成、神经球培养和Seahorse糖酵解分析评估 PAX7敲低或显性负性突变体在PTEN−/− NSCs中检测迁移、克隆形成及颅内成瘤 NOD/SCID小鼠颅内注射2×10^6个表达荧光素酶的NSCs，约35天及约70天检测肿瘤 MMC 7.5 μM处理24 h，通过FACS和TUNEL检测WT与PTEN−/− NSCs凋亡
摘要
PTEN是一种在多种癌症中频繁突变的肿瘤抑制因子。本研究表明，靶向破坏PTEN可导致人神经干细胞（NSCs）发生肿瘤性转化，但不导致间充质干细胞转化。PTEN缺失的NSCs表现出肿瘤相关的代谢和基因表达谱，并可在免疫缺陷小鼠中产生颅内肿瘤。PTEN在NSCs中定位于细胞核，通过与cAMP反应元件结合蛋白1（CREB）/CREB结合蛋白（CBP）结合而结合PAX7启动子并抑制PAX7转录。PTEN缺失导致PAX7上调，进而促进NSCs的致癌性转化，并在人胶质母细胞瘤干细胞中建立“侵袭性”。在一个大型临床数据库中，我们发现PTEN缺失的胶质母细胞瘤中PAX7水平升高。此外，我们发现丝裂霉素C选择性触发PTEN缺失NSCs的凋亡。总之，我们揭示了PTEN如何保护NSCs的潜在机制，并建立了一个细胞平台来鉴定参与NSC转化的因子，可能有助于胶质母细胞瘤的个体化治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PTEN缺失是否以及如何驱动人神经干细胞向胶质母细胞瘤干细胞样表型转化，并能否据此建立筛选平台？
- 核心机制
- PTEN在NSCs细胞核中与CREB/CBP结合于PAX7启动子并抑制PAX7转录；PTEN缺失解除该抑制，CREB/CBP介导PAX7转录激活，进而促进NSCs肿瘤性转化并增强GSCs侵袭性。
- 主要证据
- PTEN−/− NSCs在体外表现迁移和克隆形成增强、糖酵解增加，在NOD/SCID小鼠颅内形成肿瘤；PAX7敲低或显性负性突变体逆转这些表型，PAX7过表达在WT NSCs中重现表型；ChIP、荧光素酶报告和共免疫沉淀支持PTEN-CREB/CBP-PAX7通路；TCGA中PTEN与PAX7负相关。
- 研究意义
- 研究揭示PTEN保护NSCs的潜在机制，并建立可用于鉴定NSC转化相关因子及筛选靶向PTEN缺失GSCs药物的同源细胞平台，可能有助于胶质母细胞瘤个体化治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估PTEN缺失NSCs的肿瘤性表型
验证PTEN缺失是否赋予NSCs肿瘤性潜能
检测神经球生长、细胞周期、核仁和rRNA、核型与CNV、应激耐受、Transwell迁移和克隆形成；回补PTEN或shRNA敲低PTEN验证
小鼠颅内移植验证成瘤能力
验证PTEN缺失NSCs是否在脑内形成肿瘤
将表达荧光素酶的WT或PTEN−/− NSCs立体定向注射至NOD/SCID小鼠纹状体，用生物发光、MRI、H&E和免疫组化检测
解析PTEN-PAX7转录调控机制
确定PTEN缺失通过PAX7及CREB/CBP促进NSC转化
RNA-seq、ChIP-seq、RRBS/TA-RRBS、RT-qPCR、Western blot、ChIP-PCR、ChIP-qPCR、荧光素酶报告、共免疫沉淀及PAX7敲低/过表达/显性负性突变体功能实验
在患者GSCs和GBM数据中验证PTEN-PAX7轴
检验PTEN-PAX7关系是否存在于人胶质母细胞瘤
建立3株患者GSCs，shRNA敲低PTEN或过表达PAX7检测迁移和PAX7、p-AKT、p-CREB；分析TCGA 532例GBM的PTEN与PAX7相关性
筛选并验证选择性杀伤PTEN缺失NSCs的化合物
利用同源NSC平台寻找靶向PTEN缺失细胞的药物
测试具报道肿瘤杀伤活性的化合物，鉴定MMC；用FACS、TUNEL检测凋亡，并在PTEN−/− NSC颅内成瘤小鼠中经颅内给予MMC评估效果
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | PTEN-TALEN_Left | Addgene | 36764 |
| PTEN-TALEN_Right | Addgene | 36765 | |
| PTEN缺失细胞筛选 | G418 | Gibco | -- |
| 细胞培养 | mTeSR培养基 | STEMCELL Technologies | -- |
| Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| NSC神经诱导 | CHIR99021 | Cellagentech | -- |
| SB431542 | Cellagentech | -- | |
| Dorsomorphin | Sigma | -- | |
| Compound E | EMD Chemicals Inc. | -- | |
| 细胞培养与电转 | ROCK抑制剂Y-27632 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | TrypLE | Invitrogen | -- |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | Joint Protein Central | -- | |
| 人白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| Neurocult NSC基础培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| NeuroClut NSC增殖添加剂 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Accumax细胞解离液 | Millipore | -- | |
| 药物处理 | 替莫唑胺 | Sigma | -- |
| Western blot | 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9559 |
| Western blot与免疫荧光 | 抗磷酸化AKT（pSer473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| 抗磷酸化CREB（pSer133）抗体 | Cell Signaling Technology | 9198 | |
| Western blot | 抗CREB抗体 | Cell Signaling Technology | 9197 |
| 抗CBP抗体 | Abcam | ab2832 | |
| 免疫荧光 | 抗Nestin抗体 | Millipore | MAB5326 |
| 抗人细胞核抗体 | Millipore | MAB1281 | |
| 抗CD133抗体 | Miltenyi Biotec | 130-080-801 | |
| Western blot | 抗PAX7抗体 | Atsushi Kawakami | -- |
| 流式细胞术 | Click-iT EdU流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 亚硫酸氢盐测序 | CpGenome快速DNA修饰试剂盒 | Millipore | -- |
| 荧光素酶报告实验 | pGL3启动子载体 | Promega | -- |
| 荧光素酶检测 | Synergy H1混合读数仪 | BioTek | -- |
| 乳酸测定 | 比色L-乳酸检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 活体成像 | IVIS Lumina系统 | Perkin-Elmer | -- |
| 磁共振成像 | PharmaScan 7 T磁共振成像系统 | Bruker | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq建库 | TruSeq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| ChIP-seq | Covaris S2仪器 | Covaris | -- |
| 抗H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| ChIP-seq建库 | NEBNext Illumina DNA文库构建试剂盒 | NEB | -- |
| 全基因组测序 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| RRBS/TA-RRBS | PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶 | Agilent Technologies | -- |
| Western blot | 抗β-微管蛋白抗体 | Sigma | T5168 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-130301 | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光显微镜 | Leica SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PTEN敲除ESC/NSC构建 | TALEN质粒用量、G418筛选浓度50 μg ml−1及筛选14–21天、外显子1同源重组验证 阅读提示：Methods中Generation of PTEN knockout human ESCs小节及Figure 1b–d |
| NSC诱导与维持 | NIM-1/NIM-2/NSMM培养基组成、CHIR99021与SB431542浓度及诱导时间 阅读提示：Methods中Generation and characterization of NSCs小节 |
| 迁移与克隆形成实验 | Transwell接种2.5×10^4细胞、克隆形成接种2,000细胞、Matrigel包被及重复数n=3–6 阅读提示：Methods中In vitro cell migration assay与Single-cell clonal expansion assay小节及Figure 2a–d |
| 颅内移植成瘤实验 | 每侧2×10^6细胞、注射体积2 μl、立体定向坐标、NOD/SCID小鼠及检测时间35/70天 阅读提示：Methods中Mouse brain in vivo imaging小节及Figure 2e,f、Supplementary Fig. 6 |
| PAX7机制实验 | PAX7 shRNA序列、PAX7显性负性突变体片段（a.a.1–263/1–318）、981 bp启动子区域及ChIP抗体 阅读提示：Methods中Lentivirus production、ChIP and sequencing、ChIP-PCR mapping小节及Figure 4g–l |
| MMC处理与体内给药 | MMC 7.5 μM处理24 h、颅内给药方案、DMSO组n=5与MMC组n=8 阅读提示：Figure 5f–h及Results中Mitomycin C部分 |