银屑病皮肤中miR-31表达验证
确认miR-31在银屑病病变皮肤中是否表达升高
对CD18hypo小鼠病变耳皮肤与对照皮肤进行610个miRNA的筛选；用qPCR检测IMQ诱导小鼠模型和患者病变皮肤中miR-31表达；用原位杂交定位miR-31在表皮中的表达。
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NF-κB诱导的microRNA-31通过抑制蛋白磷酸酶6促进银屑病表皮增生
NF-κB-induced microRNA-31 promotes epidermal hyperplasia by repressing protein phosphatase 6 in psoriasis.
实验完整度
高结合患者样本、两种银屑病小鼠模型、条件性敲除小鼠、体外细胞实验及ChIP、Ago2-RIP和荧光素酶报告基因等多种功能与机制验证。
主要模型
IMQ诱导的银屑病小鼠模型 IL-23介导的银屑病小鼠模型 miR-31fl/fl/Keratin 5-Cre条件性敲除小鼠 人原代角质形成细胞（NHEK）及HaCaT细胞
重点核对
IMQ诱导模型：每日局部涂抹62.5 mg 5% IMQ乳膏，连续7天 IL-23诱导模型：小鼠耳部皮内注射1 μg rmIL-23（溶于25 μl PBS），隔天一次共8天 miR-31条件性敲除：miR-31fl/fl与Keratin 5-Cre杂交，在表皮基底角质形成细胞中特异性删除miR-31 细胞因子刺激：NHEK或HaCaT细胞用IL-1α、IL-6、IL-17A、IL-22、IFN-γ或TNF-α处理，浓度50 ng/ml（部分实验为10、20、50 ng/ml），处理24 h Ago2-RIP和荧光素酶报告基因验证miR-31直接靶向ppp6c 3′ UTR
摘要
NF-κB在银屑病表皮中组成性激活。然而，激活的NF-κB如何促进银屑病角质形成细胞过度增殖在很大程度上仍不清楚。在此我们报道，炎症细胞因子触发的NF-κB激活诱导microRNA（miRNA）miR-31的转录，miR-31是在银屑病患者和小鼠模型皮肤中鉴定出的最动态变化的miRNA之一。角质形成细胞中miR-31的遗传缺陷抑制其过度增殖，减少棘层肥厚并降低银屑病小鼠模型的疾病严重程度。此外，蛋白磷酸酶6（ppp6c）是一种限制G1向S期进展的负调控因子，在人银屑病表皮中减少，并被miR-31直接靶向。抑制ppp6c对miR-31介导的生物学效应具有功能重要性。此外，NF-κB激活通过诱导miR-31直接抑制ppp6c表达，并增强角质形成细胞增殖。因此，我们的数据确定NF-κB诱导的miR-31及其靶标ppp6c是银屑病表皮过度增殖的关键因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NF-κB激活如何促进银屑病角质形成细胞过度增殖和表皮增生，其下游关键内在因子是什么？
- 核心机制
- 炎症细胞因子激活NF-κB信号，NF-κB转录激活miR-31；miR-31直接靶向ppp6c（细胞周期G1-S期负调控因子）并抑制其表达，从而解除对细胞周期的限制，促进基底角质形成细胞过度增殖和表皮增生。
- 主要证据
- 在银屑病患者和小鼠模型皮肤中miR-31升高且ppp6c降低；miR-31条件性敲除减轻IMQ和IL-23诱导的小鼠银屑病样表型（减少棘层肥厚、Ki67阳性细胞和皮肤厚度）；ChIP、Ago2-RIP和3′ UTR荧光素酶报告基因证实NF-κB结合miR-31启动子及miR-31直接靶向ppp6c；敲低ppp6c促进角质形成细胞增殖和表皮增厚。
- 研究意义
- 揭示了NF-κB–miR-31–ppp6c轴介导的转录后调控机制在银屑病表皮增生中的作用，为银屑病治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NF-κB信号诱导miR-31转录
验证炎症细胞因子是否通过NF-κB信号诱导miR-31表达
用IL-1α、IL-6、IL-17A、IL-22、IFN-γ或TNF-α刺激NHEK，检测miR-31表达；用NF-κB荧光素酶报告小鼠活体成像检测IMQ处理后NF-κB活性；用ChIP验证p65结合miR-31启动子；用siRNA敲低p65检测miR-31表达；用启动子荧光素酶报告基因验证NF-κB结合位点突变对细胞因子诱导的影响。
miR-31功能获得和功能缺失验证
确定miR-31在银屑病表皮增生中的体内功能
构建miR-31转基因小鼠（miR-31TG）和miR-31fl/fl/Keratin 5-Cre条件性敲除小鼠（cKO）；在IMQ诱导和IL-23介导的银屑病小鼠模型中评估疾病表型、皮肤厚度、棘层肥厚、Ki67增殖和分化标志物表达。
miR-31直接靶向ppp6c的鉴定
鉴定miR-31在角质形成细胞中的直接靶基因
用四种生物信息学工具预测miR-31靶基因；比较WT和miR-31TG小鼠中预测靶基因的mRNA表达；用qPCR和Western blot检测ppp6c在cKO和对照小鼠表皮中的表达；用Ago2-RIP验证miR-31和ppp6c在Ago2复合物中的富集；用3′ UTR荧光素酶报告基因验证miR-31直接靶向ppp6c 3′ UTR。
ppp6c功能验证
确定ppp6c在角质形成细胞增殖和表皮增生中的功能
检测人银屑病表皮中ppp6c蛋白表达；用siRNA敲低小鼠原代角质形成细胞中ppp6c，进行细胞周期分析；用shRNA慢病毒在体内敲低ppp6c，检测表皮厚度和Ki67表达。
NF-κB–miR-31–ppp6c通路验证
验证NF-κB激活是否通过miR-31抑制ppp6c并促进角质形成细胞增殖
用IL-6刺激NHEK，检测ppp6c蛋白表达及p65敲低的影响；检测IL-6对miR-31fl/fl和cKO小鼠原代角质形成细胞增殖的影响；用BrdU掺入、划痕实验和三维器官培养评估IL-6诱导的角质形成细胞增殖；检测IL-17A对ppp6c表达的影响。
antagomir-31体内干预验证
评估靶向抑制miR-31对银屑病样表型的治疗效应
在IMQ诱导小鼠模型中皮下注射antagomir-31或阴性对照，检测棘层肥厚、真皮细胞浸润、ppp6c表达和Ki67增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| IMQ诱导银屑病小鼠模型 | 咪喹莫特乳膏（5%） | MedShine | 120503 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| RNA质量控制 | NanoDrop分光光度计 | -- | ND-1000 |
| 表皮分离 | dispase II酶 | BD | 354235 |
| cDNA合成 | SuperScript第一链合成系统 | Invitrogen | 1209992 |
| qPCR | FastStart Universal SYBR Green Master预混液 | Roche | 04913914001 |
| ViiA 7实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| miRNA反转录和qPCR | TaqMan miRNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| 原位杂交 | mmu-miR-31 5′-DIG和3′-DIG标记的miRCURY LNA检测探针 | Exiqon | 39153-15 |
| 抗DIG碱性磷酸酶抗体 | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP即用型片剂 | Roche | 11697471001 | |
| 免疫荧光染色 | 抗p65兔抗体 | Cell Signaling Technology | D14E12 |
| 含DAPI的Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P-36931 | |
| 流式细胞术 | 裂解/固定缓冲液 | BD | 51-2090KZ |
| 透化缓冲液III | BD | 558050 | |
| Fc封闭抗体 | BioLegend | 101301 | |
| 抗磷酸化p65兔抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| PE标记抗CD45抗体 | BioLegend | 103106 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG抗体 | Life Technologies | A11034 | |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD | -- | |
| 角质形成细胞分离和培养 | HBSS平衡盐溶液 | GIBCO | 14175-095 |
| 0.05%胰蛋白酶 | GIBCO | 25200-056 | |
| Chelex 100树脂 | Bio-Rad | 143-2832 | |
| 154CF培养基 | GIBCO | M-154CF-500 | |
| 人角质形成细胞生长补充剂 | GIBCO | S-001-5 | |
| 青霉素-链霉素/两性霉素B | Invitrogen | 15240-096 | |
| 角质形成细胞培养 | 正常人表皮角质形成细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0007 |
| 含生长因子的无血清基础培养基 | Lifeline Cell Technology | LL-0007 | |
| ChIP | SimpleCHIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9002 |
| Branson W250D超声破碎仪 | Branson | -- | |
| RNA干扰 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778 |
| Western blot | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78440 |
| 小鼠抗actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| 兔抗ppp6c抗体 | Abcam | EPR8764 | |
| 大鼠抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| 兔抗小鼠Ki67抗体 | eBioscience | 42-5698 | |
| 荧光素酶报告基因 | pGL3-basic载体 | Promega | E1751 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| 酶标仪 | Berthold | TriStar LB941 | |
| 3′ UTR荧光素酶报告基因 | psiCHECK-2载体 | Promega | C8021 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Scientific | SH30243.01B |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437036 | |
| 3′ UTR荧光素酶报告基因 | TurboFect转染试剂 | Thermo Scientific | R0531 |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 92590 |
| 抗Ago2抗体 | Abcam | ab32381 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶溶液 | Calbiochem/EMD | -- |
| 体内shRNA递送 | pLVX-shRNA2载体 | Clontech | 632179 |
| BrdU掺入实验 | 溴脱氧尿苷 | Sigma | B5002 |
| APC标记抗BrdU抗体 | BioLegend | 339808 | |
| 碘化丙啶 | Life Technologies | S10274 | |
| 三维细胞培养 | 人真皮成纤维细胞 | Sciencell | 2320 |
| I型胶原凝胶 | Shengyou Biotechnology | 200110-50 | |
| DermaLifeK完全培养基 | Lifeline Cell Technology | LL-0007 | |
| 成纤维细胞培养基 | Sciencell | 2301 | |
| 细胞滤网 | Falcon | 352350 | |
| IL-23诱导银屑病小鼠模型 | 重组小鼠IL-23 | R&D Systems | 1887-ML-010 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IMQ诱导银屑病小鼠模型 | IMQ乳膏浓度5%、每日剂量62.5 mg、涂抹面积（剃毛背部）、连续7天、小鼠品系C57BL/6J、性别雌性、年龄8–12周 阅读提示：Methods中“IMQ-induced mouse model of psoriasis”小节 |
| IL-23诱导银屑病小鼠模型 | rmIL-23剂量1 μg/耳（25 μl PBS）、注射方式皮内、注射频率隔天一次共4次（第1、3、5、7天）、检测终点第8天 阅读提示：Methods中“IL-23-mediated mouse of psoriasis”小节 |
| miR-31条件性敲除小鼠构建 | miR-31fl/fl小鼠与Keratin 5-Cre转基因小鼠杂交，表皮基底角质形成细胞特异性删除miR-31；基因型鉴定引物P1/P2及产物大小（floxed 1,064 bp，删除型235 bp） 阅读提示：Methods中“Generation of miR-31fl/fl/Keratin 5-Cre mice”小节 |
| 细胞因子刺激实验 | 细胞因子种类（IL-1α、IL-6、IL-17A、IL-22、IFN-γ、TNF-α）、浓度（50 ng/ml，部分实验0、10、20、50 ng/ml）、处理时间24 h、细胞类型（NHEK或HaCaT） 阅读提示：Results中“NF-κB activation induces miR-31 expression”及图2b；Methods中相关细胞培养小节 |
| antagomir-31体内干预 | antagomir-31剂量10 nmol、注射方式皮内、首次注射在IMQ应用前3天、之后隔天一次至实验结束、IMQ处理7天 阅读提示：Methods中“In vivo miR-31 interference”小节；图7图注 |
| Ago2-RIP | 抗Ago2抗体用量5 μg、阴性对照（正常兔IgG）、阳性对照（anti-SNRNP70）、qPCR检测ppp6c和miR-31 阅读提示：Methods中“RNA-binding protein immunoprecipitation”小节 |
| 荧光素酶报告基因（启动子） | pGL3-basic载体500 ng、pRL-TK renilla载体50 ng、转染试剂Lipofectamine 2000、细胞因子处理浓度50 ng/ml 24 h、检测系统Dual-Luciferase 阅读提示：Methods中“Luciferase reporter assays”小节 |
| 荧光素酶报告基因（3′ UTR） | psiCHECK-2载体100 ng、miR-31 mimics 50 pmol、转染试剂TurboFect、细胞系NIH3T3、检测系统Dual-Luciferase 阅读提示：Methods中“Luciferase reporter assays”小节 |
| ppp6c shRNA慢病毒体内递送 | 慢病毒滴度1×10^8–2×10^8 TU/ml、注射体积100 μl、注射方式皮内、小鼠品系C57BL/6J雌性8周龄、IMQ处理7天后检测 阅读提示：Methods中“In vivo administration of Ppp6c shRNA lentivirus”小节 |
| 细胞周期分析 | 细胞类型（小鼠原代角质形成细胞或NHEK）、siRNA浓度（20 μM）、处理时间（24或48 h）、固定和染色方法（70%乙醇固定、碘化丙啶染色） 阅读提示：Methods中“Cell cycle analysis of keratinocytes”小节 |
| BrdU掺入实验 | BrdU终浓度10 μM、孵育时间1 h、细胞类型NHEK、检测抗体APC-anti-BrdU 阅读提示：Methods中“BrdU incorporation assay”小节 |
| 三维器官培养 | HaCaT细胞密度3×10^6/凝胶、人真皮成纤维细胞5×10^5/孔、I型胶原凝胶、IL-6浓度50 ng/ml、培养时间1周 阅读提示：Methods中“Three-dimensional cell culture”小节 |