构建跨物种细胞时空基因表达框架
系统比较小鼠、人类和类器官皮层发育中细胞类型特异性基因表达动态。
整合公开scRNA-seq数据集，使用序数回归模型构建二维细胞流形（年龄×分化状态），生成基因表达景观，并通过机器视觉聚类分析。
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驱动物种特异性皮层特征的发育基因表达模式
Developmental gene expression patterns driving species-specific cortical features.
实验完整度
高包含多物种/多上下文单细胞转录组分析、小鼠在体与类器官功能获得/缺失实验、CUT&Tag/CUT&RUN表观遗传验证及跨物种GRN分析。
主要模型
小鼠胚胎皮层（E12-E17及E15.5在体电转） 人胚胎新皮层（PCW12-PCW24） 人皮层类器官（OrgH，2-7个月）
重点核对
JUNB在人类RG和小鼠神经元中的互斥表达模式，通过scRNA-seq景观和免疫染色验证 JUNB敲低（CRISPRi）在OrgH中增加神经元/祖细胞比例 JUNB过表达在小鼠RG中增加RG数量、延长神经发生并增加神经元产出（Tracker-seq克隆分析） JUNB通过结合DNA并改变H3K27ac修饰调控细胞周期相关靶基因 IRF1在人类RG中特异性表达，可直接结合JUNB启动子并激活小鼠Junb表达，诱导人类RG样特征
摘要
大脑皮层在大小和组织结构上表现出物种特异性差异，这可能解释了不同的行为能力。这些结构差异可能反映了共享基因在发育表达中的进化变化。在此，为了研究这一可能性，我们使用机器视觉来识别和比较发育中的小鼠和人类新皮层以及人类皮层类器官中细胞类型特异性的基因表达模式。使用这种方法，我们识别了具有进化上保守或分化的转录调控的基因，揭示了物种特异性的细胞时空基因表达模式。在这些基因中，转录因子基因JUNB在人类祖细胞和小鼠神经元中表现出互斥性表达。通过在小鼠和人类皮层类器官中进行细胞类型特异性的功能获得和功能缺失实验，我们表明JUNB双向控制人类皮层特征，包括祖细胞增殖速率、神经元产生时间和总神经元输出。我们将IRF1鉴定为人类放射状胶质细胞特异性调节因子，当其在小鼠放射状胶质细胞中表达时，可激活JUNB并招募人类样基因调控网络，证明了 poised 发育程序的跨物种激活。总之，这些发现揭示了共享基因的细胞时空调控如何驱动物种特异性皮层特征，并为理解和操纵这些进化程序提供了分子框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 共享基因的发育表达时序差异如何驱动物种特异性皮层特征？
- 核心机制
- JUNB在人类RG中表达并促进祖细胞增殖和延长神经发生，而IRF1作为人类RG特异性上游因子激活JUNB，共同调控人类皮层特征。
- 主要证据
- 跨物种scRNA-seq景观分析鉴定JUNB互斥表达；小鼠在体电转和OrgH CRISPRi功能实验证明JUNB双向调控祖细胞增殖和神经元输出；CUT&Tag/CUT&RUN和GRN分析揭示IRF1直接调控JUNB。
- 研究意义
- 揭示了共享基因的细胞时空调控如何驱动物种特异性皮层特征，为理解和操纵这些进化程序提供了分子框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定物种间保守与分化的基因表达程序
识别在物种和上下文间表达模式保守或分化的基因。
对基因表达景观进行两两相关性分析，分类为保守、物种特异性、上下文特异性和分化四类，并进行GO富集分析。
JUNB功能验证：敲低与过表达实验
验证JUNB在人类RG和小鼠神经元中的功能作用。
在OrgH中使用CRISPRi敲低JUNB，在小鼠E15.5使用在体电转过表达JUNB，分析神经元/祖细胞比例、克隆大小和细胞周期。
JUNB下游靶基因和表观调控机制
鉴定JUNB直接靶基因及其对染色质状态的影响。
使用CellOracle进行计算机模拟扰动预测JUNB靶基因，CUT&Tag分析JUNB结合位点和H3K27ac修饰，snRNA-seq验证靶基因表达变化。
IRF1上游调控验证
验证IRF1作为人类RG特异性上游因子调控JUNB表达。
在OrgH中进行CUT&RUN验证IRF1结合JUNB启动子；在小鼠中共电转IRF1和JUNB启动子报告系统，分析报告基因激活、Junb表达、转录组变化和神经元生成时序。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354277 |
| mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| mTeSR Plus培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Accutase细胞解离液 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 温和细胞解离试剂 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 类器官培养 | STEMdiff脑类器官试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| 在体电转 | 固绿FCF | Sigma | -- |
| BrdU/EdU标记 | 溴脱氧尿苷 | Thermo Fisher Scientific | B23151 |
| 乙炔脱氧尿苷 | Thermo Fisher Scientific | A10044 | |
| 免疫荧光 | 抗SOX2抗体 | Atlas | AMAb91307 |
| 抗TBR2抗体 | R&D Systems | AF6166 | |
| 抗GFP抗体 | Aves Labs | GFP-1020 | |
| 抗NEUROD2抗体 | Abcam | ab109406 | |
| 抗JUNB抗体 | Proteintech | 10486-1-AP | |
| CUT&RUN/CUT&Tag | CUT&RUN试剂盒 | Cell Signaling Technologies | 86652 |
| CUT&Tag试剂盒 | Cell Signaling Technologies | 77552 | |
| CUT&RUN | 抗IRF1抗体 | Proteintech | 11335-1-AP |
| 抗H3K4me3抗体 | CST | 9751 | |
| CUT&Tag | 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab177178 |
| CUT&RUN/CUT&Tag | 正常兔IgG | CST | 2729 |
| 山羊抗兔IgG | CST | 35401 | |
| 质粒构建 | pCS2-Flag-JUNB质粒 | Addgene | 29687 |
| pX458-CRISPRi质粒 | Addgene | 175573 | |
| tFucci(SA)5质粒 | Addgene | 153520 | |
| EGR1过表达质粒 | Addgene | 144888 | |
| NEB HiFi DNA组装试剂盒 | NEB | E2621S | |
| BbsI-HF限制酶 | NEB | R3539S | |
| 单细胞测序 | 10X Genomics Chromium单细胞v3.1试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Chromium X控制器 | 10X Genomics | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq 5000测序仪 | Illumina | -- | |
| 显微成像 | MICA Leica显微镜 | Leica | -- |
| Zeiss LSM800/880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Nikon Ti2 Eclipse显微镜 | Nikon | -- | |
| 流式分选 | BD FACSMelody流式细胞分选仪 | BD | -- |
| Beckman Coulter MoFlo Astrios流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 跨物种scRNA-seq整合与景观生成 | 数据集选择（小鼠E12-E17、人类PCW12-PCW24、OrgH 2-7个月）、细胞过滤标准（表达基因>1%细胞）、每种细胞类型和年龄随机采样平衡细胞数 阅读提示：Methods 'Data source and selection'、'Data integration and cell-type annotation'、'Gene expression landscapes'及Supplementary Table 1 |
| JUNB敲低（OrgH CRISPRi） | 电转时间（DIV43）、质粒浓度（1-2 μg/μl）、电转参数（80V，5脉冲，1ms，间隔1s）、分析时间（电转后7天）、 ventricle水平定量 阅读提示：Methods 'Generation, culture and electroporation of cerebral organoids'及Fig. 4c legend、Extended Data Fig. 12b,c |
| JUNB过表达（小鼠在体电转） | 电转时间（E15.5）、质粒浓度、电转参数（50V，5脉冲，50ms，1Hz）、BrdU/EdU注射剂量（BrdU 200mg/kg，EdU 200mg/kg）、分析时间点（E16.5或P1） 阅读提示：Methods 'In utero electroporation of mouse embryos'、'BrdU and EdU injection'及Fig. 4d,e legend |
| CUT&Tag/CUT&RUN | 组织来源（DIV40 OrgH或小鼠E15电转后24h皮层）、抗体稀释比（1:50）、细胞投入量（CUT&Tag 36,000细胞）、文库扩增循环数（14 cycles） 阅读提示：Methods 'CUT&RUN and CUT&Tag tissue processing and analysis'及Supplementary Figure 1 |
| IRF1启动子报告实验 | 报告质粒构建（人JUNB启动子驱动Scarlet3，小鼠Junb启动子驱动eGFP）、IRF1结合基序突变（GAAA→ATGC）、电转时间（E15.5或E16.5）、分析时间（电转后24h-2天） 阅读提示：Methods 'Plasmids'及Fig. 5b,e legend、Extended Data Fig. 15e,f |