细胞质染色质与cGAS-STING激活检测
验证衰老细胞中细胞质染色质是否激活cGAS-STING通路。
在多种原代细胞中诱导衰老，检测CCF标志物、cGAS与CCF共定位、cGAMP产生及STING二聚化和聚集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
细胞质染色质在衰老和癌症中触发炎症
Cytoplasmic chromatin triggers inflammation in senescence and cancer.
实验完整度
高包含体外原代细胞、小鼠体内模型、患者肿瘤数据库及机制验证
主要模型
原代IMR90和BJ人成纤维细胞 Sting野生型与缺失型C57BL/6小鼠 NRasV12肝细胞癌小鼠模型 人乳腺癌细胞系及CCLE/TCGA癌症数据集
重点核对
IMR90细胞以100 µM依托泊苷处理48 h后于第7天收获诱导衰老；BJ细胞以40 µM依托泊苷持续处理 STING+/+与STING−/−小鼠接受4 Gy亚致死剂量电离辐射，7天后取肝脏行IHC，n=8 hydrodynamic尾静脉注射20 µg NRasV12/luciferase与10 µg转座酶质粒，8–12周龄小鼠，第6天取肝脏 慢病毒pLKO shRNA敲低cGAS、STING、IFI16或Lamin B1，嘌呤霉素或潮霉素筛选 RNA-seq使用两个独立生物学重复，差异基因>3倍变化用于GO分析；CCLE和TCGA按表达最高/最低25%分组比较
摘要
染色质传统上被视为调节基因表达和沉默的核内实体。然而，我们最近发现，在衰老（一种与促炎反应相关的终末细胞周期停滞形式）过程中，原代细胞完整细胞核会脱落出细胞质染色质片段。染色质存在于细胞质中的功能意义尚不清楚。本文中我们展示，细胞质染色质激活先天免疫胞质DNA感应cGAS-STING通路，导致既能限制活化癌基因的短期炎症，也能引起与组织破坏和癌症相关的慢性炎症。细胞质染色质-cGAS-STING通路在原代人细胞和小鼠中促进衰老相关分泌表型（SASP）。STING缺陷小鼠对致癌RAS的免疫监视受损，并且电离辐射后组织炎症减轻。此外，该通路在癌细胞中被激活，并与人类癌症中的促炎基因表达相关。总体而言，我们的发现表明，基因组DNA可作为储库，在衰老和癌症中于细胞质内启动促炎通路。靶向细胞质染色质介导的通路可能有望用于治疗炎症相关疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞质染色质是否具有生物学功能，以及其在衰老和癌症中是否通过cGAS-STING通路介导炎症。
- 核心机制
- 细胞质染色质片段被胞质DNA感受器cGAS识别，产生cGAMP并激活STING，进而通过NFκB促进SASP和促炎基因表达；衰老中干扰素通路受到抑制。
- 主要证据
- 在原代人成纤维细胞中敲低cGAS或STING降低SASP基因和分泌因子；Lamin B1过表达减少CCF并抑制SASP；Sting缺失小鼠中电离辐射和NRasV12诱导的SASP、炎症及免疫清除受损，并出现肝肿瘤；CCLE和TCGA分析显示STING与促炎基因表达正相关。
- 研究意义
- 研究提示基因组DNA可作为细胞质“危险信号”警报免疫系统，细胞质染色质-cGAS-STING通路在衰老和癌症炎症中发挥作用，靶向该通路可能有望治疗炎症相关疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
cGAS-STING对SASP的调控验证
验证cGAS-STING是否促进SASP程序。
稳定敲低cGAS或STING后诱导衰老，检测SASP标志物、RNA-seq和分泌因子；并在已建立衰老后失活cGAS或STING。
CCF生成与SASP的因果验证
验证CCF本身是否足以通过cGAS依赖方式诱导SASP。
过表达Lamin B1减少CCF，或外源转染dsDNA90及染色质片段，检测STING二聚化、p65磷酸化和SASP基因。
小鼠体内STING对SASP和免疫监视的验证
验证STING在体内DNA损伤和Ras诱导衰老中对SASP、炎症和免疫清除的作用。
对STING+/+和STING−/−小鼠进行电离辐射或 hydrodynamic注射NRasV12，检测肝脏SASP、炎症、免疫细胞标志物、荧光素酶信号和肝肿瘤。
衰老逃逸和癌细胞中的细胞质染色质通路
验证衰老逃逸细胞和癌细胞中细胞质染色质-cGAS-STING通路是否仍激活促炎基因。
构建OIS逃逸细胞，检测CCF、cGAS共定位和促炎基因；检测多种癌细胞系，并结合CCLE和TCGA数据分析STING、cGAS、Lamin B1与促炎基因表达的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | Invitrogen | -- | |
| 链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 依托泊苷 | Sigma | -- |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma | -- | |
| 潮霉素 | Gemini Bio Products | -- | |
| 动物实验 | 荧光素 | PerkinElmer | -- |
| 药物处理 | 重组人IL1α蛋白 | R&D Systems | -- |
| p38 MAPK抑制剂SB203580 | Selleck Chemicals | -- | |
| Western blot | 抗γH2AX抗体 | Abcam | ab2893 |
| 抗γH2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗STING抗体 | LSBio | LS-B7237 | |
| 抗cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | 15102 | |
| 抗cGAS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-245858 | |
| 抗人IL1α抗体 | Abcam | ab9614 | |
| 抗IL8抗体 | Abcam | ab18672 | |
| 抗p-ATM S1981抗体 | Abcam | ab81292 | |
| 抗p-p53 S15抗体 | Cell Signaling Technology | 9284 | |
| 抗p-p65 S536抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗NRas抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-31 | |
| 免疫组织化学 | 抗CD3抗体 | Abcam | ab16669 |
| 抗Mac2抗体 | BioLegend | 125401 | |
| 抗小鼠IL1α抗体 | R&D Systems | AF-400 | |
| Western blot | 抗p21抗体 | -- | sc-471 |
| 抗H3抗体 | Active Motif | 39763 | |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | -- | |
| NuPAGE Bis-Tris预制胶 | Life Technologies | -- | |
| 苯佐酶 | Novagen | -- | |
| GE Amersham Imager 600成像仪 | GE | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor偶联二抗 | Life Technologies | -- |
| ProLong Gold封片剂 | Life Technologies | -- | |
| Leica TCS SP8荧光共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| DNase I | Qiagen | -- | |
| High-Capacity RNA-to-cDNA试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| 7900HT快速实时PCR平台 | ABI | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | Dynabeads Protein A磁珠 | Invitrogen | -- |
| Covaris超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| RNA-seq | Scriptseq Complete试剂盒 | Epicentre | -- |
| NextSeq 500测序平台 | Illumina | -- | |
| 生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 分泌细胞因子分析 | 人细胞因子阵列C1 | RayBiotech | -- |
| 3kDa Amicon Ultra 0.5 mL离心过滤器 | Millipore | -- | |
| cGAMP检测 | EASY-nLC纳升级高效液相色谱 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 2’3’-cGAMP标准品 | InvivoGen | -- | |
| 苯基-己基树脂 | Phenomenex | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞衰老诱导 | IMR90以100 µM依托泊苷处理48 h后换液并于第7天收获；BJ细胞以40 µM持续处理；细胞在3%生理氧下培养，群体倍增≤35。 阅读提示：Methods“Cell culture and treatment” |
| 慢病毒敲低与筛选 | pLKO shRNA序列、嘌呤霉素或潮霉素筛选浓度；STING、cGAS、IFI16、Lamin B1各两条shRNA。 阅读提示：Methods“Retrovirus and lentivirus”及shRNA列表 |
| 免疫印迹STING二聚体检测 | 非还原条件、不加还原剂；p-ATM检测需benzonase 12.5 U/ml裂解。 阅读提示：Methods“Immunoblotting” |
| 小鼠电离辐射实验 | 4 Gy亚致死剂量，7天后取肝脏行IHC，n=8；小鼠为C57BL/6背景STING+/+和STING−/−。 阅读提示：Methods“Mice experiments”及Fig. 3a图注 |
| NRasV12肝细胞模型 | 20 µg NRasV12/luciferase加10 µg转座酶质粒，8–12周龄小鼠，Ringer's液体积为体重10%，6秒内完成 hydrodynamic注射；第6天取肝脏，WT n=10、null n=13。 阅读提示：Methods“Mice experiments”及Fig. 3f图注 |
| 荧光素酶体内成像 | 荧光素腹腔注射150 mg/kg，异氟烷麻醉，IVIS Spectrum每分钟成像共15 min，取峰值信号。 阅读提示：Methods“Mice experiments” |
| cGAMP质谱检测 | 细胞用80:20甲醇:水提取，m/z 675.10 [M+H]1+，HCD碰撞能量25，Orbitrap分辨率15,000。 阅读提示：Methods“2’3’-cGAMP detection by LC-MS/MS” |
| RNA-seq分析 | 两个独立生物学重复；Trimmomatic 0.32、STAR 2.3.0e、featureCounts 1.5.0、DESeq2；差异>3倍基因用于GO分析。 阅读提示：Methods“RNA-sequencing” |
| CCLE和TCGA分组比较 | 按目标基因表达排序后四等分，比较最低25%与最高25%组；单侧Wilcoxon秩和检验，P<0.05显著。 阅读提示：Methods“The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) analyses” |