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        利用工程化病毒样颗粒的活细胞转录组学

        Live-cell transcriptomics with engineered virus-like particles.

        作者信息Mohamad Ali Najia, Anna Le, Jacob Borrajo, Lauren Pruett, FuNien Tsai, Ryan Ogi, Jeremy Y Huang, Linda G Griffith, George Q Daley, Paul C Blainey
        PMID42679822
        期刊Cell
        发布时间2026-10-01
        DOI10.1016/j.cell.2026.08.005
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含细胞系、原代细胞、iPSC分化、微生理系统等多层级模型，并进行RNA-seq、功能验证和机制分析

        主要模型

        HEK293T细胞系 HT1080纤维肉瘤细胞系 iNGN诱导多能干细胞向神经元分化模型 HUVEC原代内皮细胞球体和微生理系统

        重点核对

        VLP中GAPDH mRNA在RNase处理和37°C孵育4天后仍稳定 RNA-seq检测细胞培养基中基因数与细胞裂解物相当，且表达相关性r=0.797 CellNet分类证实VLP来源转录组可识别细胞类型 iNGN分化4天中，细胞培养基检测到772个差异表达基因与裂解物一致 微生理系统中每24小时采样，检测血管生成相关时间动态基因

        摘要

        转录组分析广泛用于表征细胞基因表达，但现有方法裂解细胞，无法对同一样本随时间直接分析转录动态。我们通过工程化哺乳动物细胞，使其通过病毒样颗粒（VLP）输出mRNA来“自我报告”转录状态，从而解决了这一限制。对产生VLP的细胞群体反复采样培养基，忠实捕获了复杂生物环境中的转录状态演变，包括原代细胞球体的急性炎症刺激和多能干细胞的多日分化。我们工程化VLP组分，实现了共培养中不同细胞类型的多重读数，并可调节自我报告的RNA谱。最后，我们展示了自我报告在微生理共培养系统封闭结构内选择性纵向追踪内皮细胞动态的独特效用，以识别血管生成背后的血管周围基质依赖性时间基因程序。总之，这项工作确立了细胞自我报告作为一种广泛适用的活细胞转录组范围基因表达谱分析技术。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        能否在不破坏细胞的情况下，对活细胞进行纵向、全转录组范围的基因表达谱分析，以研究动态生物过程？
        核心机制
        MMLV Gag蛋白非特异性包装细胞RNA进入病毒样颗粒并输出到培养基，从而实现对活细胞转录状态的非破坏性、纵向监测；工程化Gag-RBP融合可调节RNA包装偏好。
        主要证据
        在HEK293T、HT1080、iPSC来源神经元、原代HUVEC球体和微生理系统中，VLP来源RNA与细胞裂解物转录组相关，并能捕获分化、炎症刺激和血管生成过程中的动态基因表达变化。
        研究意义
        细胞自我报告为活细胞转录组学提供了广泛适用的技术，可用于研究传统破坏性方法难以分析的动态生物过程，并在微生理系统中实现纵向转录组分析。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        构建MMLV Gag介导的RNA输出系统

        验证MMLV Gag能否包装并输出细胞RNA到VLP中

        将MMLV Gag全长或GagΔMA对照转染HEK293T细胞，收集培养基，通过Western blot、qPCR、电子显微镜和RNA-seq检测VLP和RNA

        2

        评估VLP RNA与细胞裂解物转录组的一致性

        确定VLP来源RNA能否代表细胞转录组

        对Gag表达细胞的培养基和细胞裂解物进行RNA-seq，比较基因检测数、表达相关性和细胞类型分类

        3

        纵向采样监测iPSC向神经元分化

        验证反复采样能否捕获多日分化中的转录动态

        对Gag表达iNGN iPSC进行多西环素诱导分化，每24小时收集培养基和裂解物，进行RNA-seq和差异表达分析

        4

        原代HUVEC球体对TNFα的急性转录响应

        验证自我报告能否捕获三维培养原代细胞的急性转录变化

        将Gag表达HUVEC形成球体或单层培养，用TNFα刺激，在0和14小时收集培养基进行RNA-seq

        5

        工程化VLP实现多重和选择性自我报告

        实现共培养中不同细胞类型的转录组分别读取

        用表位标签VSV-G假型化VLP，通过FLAG/HA免疫沉淀分离特定细胞来源VLP，进行RNA-seq和CellNet分类

        6

        工程化Gag-eIF4E融合调节RNA包装

        探究Gag-RBP融合能否改变VLP包装RNA的偏好

        将eIF4E融合到Gag C端，转染HEK293T和HeLa细胞，比较VLP RNA与细胞裂解物的相关性、差异表达基因和细胞类型分类

        7

        微生理系统中纵向追踪血管生成

        在封闭微生理系统中监测内皮细胞血管生成的转录动态

        将Gag-eIF4E表达HUVEC与NHLF或ESC基质细胞共培养于微生理设备，连续灌流7天，每24小时收集灌流培养基进行RNA-seq和GAM分析

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        构建和验证自我报告系统
        瞬时转染慢病毒转导piggyBac转座蛋白质印迹扫描电子显微镜免疫荧光显微镜流式细胞术
        检测RNA输出和稳定性
        逆转录定量PCRRNase处理实验RNA测序SMART-Seq2
        分离和纯化VLP
        超速离心免疫沉淀Amicon过滤浓缩
        分析转录组数据
        主成分分析差异基因表达分析基因集富集分析CellNet分类广义加性模型梯度提升回归SHAP分析
        评估细胞功能和分化
        CellTiter-Glo检测球体形成实验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基Invitrogen10566016
        StemFlex培养基Stem Cell TechnologiesA3349401
        mTeSR培养基Stem Cell Technologies85850
        VascuLife培养基Lifeline Cell TechnologyLL-0003
        hESC qualified基质胶Corning354277
        ReleSR细胞解离试剂Stem Cell Technologies100-0483
        RevitaCell添加剂ThermoFisher ScientificA2644501
        EGM-2培养基LonzaCC-3162
        M199培养基Sigma-AldrichM4530
        肝素Stem Cell Technologies07980
        重组人VEGFR&D Systems293-VE-500
        重组人bFGFGibco13256029
        重组人EGFR&D Systems236-EG-200
        重组人IGF-IPeproTech100-11
        细胞刺激重组人TNFαPeproTech300-01A-50UG
        转染Lipofectamine 3000转染试剂ThermoFisher ScientificL3000015
        免疫荧光鬼笔环肽AF488ThermoFisher ScientificA12379
        慢病毒转导聚凝胺Santa Cruz Biotech28728-55-4
        细胞培养快速包被液Angio-ProteomiecAP-01
        细胞筛选嘌呤霉素ThermoFisher ScientificA1113803
        ZeocinThermoFisher ScientificR25001
        分子克隆Esp3I限制酶ThermoFisher ScientificFD0454
        T7连接酶EnzymaticsL6020L
        免疫沉淀抗FLAG M2磁珠Sigma-AldrichM8823
        3xFLAG肽Sigma-AldrichF4799
        Pierce抗HA磁珠ThermoFisher Scientific88836
        HA肽ThermoFisher Scientific26184
        RNA提取1X TCL缓冲液Qiagen1031576
        2X TCL缓冲液Qiagen1070498
        RNA-seq脱氧核苷酸溶液混合物NEBN0447L
        SUPERase·In RNase抑制剂ThermoFisher ScientificAM2694
        甜菜碱溶液Sigma-AldrichB0300-1VL
        Maxima H Minus逆转录酶ThermoFisher ScientificEP0751
        RNAse处理RNase混合酶ThermoFisher ScientificAM2286
        蛋白提取无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Sigma-Aldrich4693159001
        Western blot2X Tris-Glycine SDS上样缓冲液Life TechnologiesLC2676
        10X NuPAGE还原剂Life TechnologiesNP0009
        Novex WedgeWell 8-16% Tris-Glycine凝胶Life TechnologiesXP08165BOX
        PVDF iBlot 2转印膜Life TechnologiesIB24002
        印迹级脱脂奶粉Bio-Rad1706404XTU
        细胞分化多西环素盐酸盐Sigma-AldrichD9891-5G
        球体形成Cytodex-3微载体Cytiva17048501
        质粒提取质粒Plus Midi试剂盒Qiagen12945
        RNA提取QIAamp病毒RNA迷你试剂盒Qiagen52904
        RNeasy Plus迷你试剂盒Qiagen74134
        DNA纯化DNA清洁浓缩柱Zymo ResearchD4033
        过滤低蛋白结合0.45 μm滤器VWR28145-481
        浓缩Amicon 100 kDa MWCO离心滤器Millipore SigmaUFC810096
        测序Agilent高灵敏度DNA试剂盒Agilent5067-4626
        分子克隆Gibson组装预混液NEBE2611L
        RNA纯化RNAClean XP SPRI磁珠Beckman CoulterA63987
        DNA纯化AMPure XP SPRI磁珠Beckman CoulterA63881
        PCRKAPA HiFi HotStart预混液Roche07958935001
        NEBNext高保真2X PCR预混液NEBM0541L
        RT-qPCRJumpStart Taq DNA聚合酶预混液Sigma-AldrichP2893
        cDNA合成iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad1708890
        细胞活力检测CellTiter-GloPromegaG7572
        Nuncleon白色聚苯乙烯96孔检测板ThermoFisher Scientific136101
        单细胞分选384孔TC处理微孔板Corning3764BC
        RT-qPCR人GAPDH qPCR引物/探针组ThermoFisher ScientificHs02758991_g1
        核转染Lonza细胞系核转染试剂盒VLonzaVCA-1003
        测序AVITI 2x150测序试剂盒Cloudbreak FS高输出Element Biosciences860-00013
        抗体兔抗Gag抗体Abcamab100970
        兔抗肌动蛋白抗体Abcamab179467
        山羊抗兔IgG AF647ThermoFisher ScientificA32733
        小鼠抗肌动蛋白抗体ThermoFisher ScientificMA5-11869
        山羊抗小鼠IgG AF488ThermoFisher ScientificA11001
        小鼠抗EEA1抗体BD Biosciences610457
        山羊抗小鼠IgG AF647ThermoFisher ScientificA21235
        抗人CD56 FITC抗体BioLegend362546
        抗人CD31 BV421抗体BioLegend303123
        小鼠抗人CD144 AF647抗体BD Biosciences561567
        小鼠抗人CD31 AF594抗体BioLegend303126

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        VLP生产和采样
        细胞数量（≥100,000）、VLP生产时间（通常48小时）、培养基收集体积（全部）
        阅读提示：Methods中“VLP purification from cell media”和“VLP sampling interval experiments”
        iPSC向神经元分化
        iNGN iPSC接种密度（45 colonies/cm2）、多西环素浓度（0.5 μg/mL）、分化时间（4天）、采样间隔（24小时）
        阅读提示：Methods中“Live-cell transcriptomics of iPS-to-neuron differentiation”
        HUVEC球体TNFα刺激
        HUVEC传代次数、球体形成条件（1百万细胞与2,500 beads共孵育4小时）、TNFα浓度（30 ng/mL）、刺激时间（14小时）
        阅读提示：Methods中“TNFα stimulation of self-reporting HUVEC spheroids”
        微生理系统血管生成
        HUVEC与基质细胞比例（7:1）、每设备细胞数（180,000 HUVEC和25,714基质细胞）、灌流时间（7天）、采样间隔（24小时）
        阅读提示：Methods中“Live-cell transcriptional time-course of vasculogenesis in microphysiological systems”
        RNA-seq建库
        SMART-Seq2使用的RNA输入量、PCR循环数（21 cycles）、测序配置
        阅读提示：Methods中“RNA-sequencing with SMART-Seq2”

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