肿瘤浸润CD8 T细胞中SERT表达检测
验证SERT在肿瘤浸润CD8 T细胞中是否上调。
从B16-OVA小鼠肿瘤中分选CD8 T细胞亚群，RT-qPCR检测Sert mRNA表达。
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5-羟色胺转运体通过调控瘤内5-羟色胺轴抑制抗肿瘤免疫
Serotonin transporter inhibits antitumor immunity through regulating the intratumoral serotonin axis.
实验完整度
高包含多种同系小鼠肿瘤模型、基因敲除小鼠、骨髓移植、过继转移、体外T细胞实验、人源化异种移植模型及临床数据相关性分析，具备功能验证和机制验证。
主要模型
B16-OVA小鼠黑色素瘤同系模型 MC38小鼠结肠癌同系模型 Sert-KO与Sert-WT C57BL/6J小鼠 A375-A2-ESO-FG人黑色素瘤NSG异种移植模型
重点核对
SSRI剂量：小鼠腹腔注射fluoxetine 10 mg/kg/day或citalopram 30 mg/kg/day 抗PD-1抗体剂量：300 μg/只，每周两次腹腔注射 CD8 T细胞清除：抗小鼠CD8抗体200 μg/只，每周两次 肿瘤接种细胞数：B16-OVA 1×10^6/只；MC38 5×10^5/只；A375-A2-ESO-FG 10×10^6/只 SSRI体外处理浓度：fluoxetine 2 μM，citalopram 20 μM
摘要
鉴定阻碍抗肿瘤T细胞应答的额外免疫检查点是开发下一代癌症免疫疗法的关键。在此，我们报道了5-羟色胺转运体（SERT），一种在脑和外周组织中调节5-羟色胺水平和生理功能的调节因子，在肿瘤浸润CD8 T细胞中被诱导表达。使用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs，最广泛处方的抗抑郁药）抑制SERT，在多种小鼠同系和人类异种移植肿瘤模型中显著抑制了肿瘤生长并增强了T细胞抗肿瘤免疫。重要的是，SSRI治疗与程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断表现出显著的协同治疗作用，并且临床数据相关性研究在一系列癌症中将瘤内SERT表达与患者生存呈负相关。在机制上，SERT作为负反馈调节因子，通过耗竭瘤内T细胞自分泌的5-羟色胺来抑制CD8 T细胞反应性。这些发现强调了瘤内5-羟色胺轴的重要性，并将SERT鉴定为免疫检查点，将SSRIs定位为癌症免疫治疗的有前景的候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SERT是否调控瘤内5-羟色胺轴并影响CD8 T细胞抗肿瘤免疫，以及SSRIs是否可用于癌症免疫治疗。
- 核心机制
- SERT作为负反馈调节因子，通过重摄取耗竭瘤内CD8 T细胞自分泌的5-羟色胺，限制5-HTR-MAPK-TCR信号通路，从而抑制CD8 T细胞反应性。
- 主要证据
- 多种同系小鼠肿瘤模型、Sert-KO小鼠及骨髓移植实验显示SERT缺失或SSRI处理抑制肿瘤生长并增强CD8 T细胞效应功能；体外实验证明SSRI增强CD8 T细胞增殖和效应分子表达，且该效应可被5-HTR拮抗剂阻断；HPLC显示SSRI处理升高瘤内5-羟色胺水平。
- 研究意义
- 作者提出SERT是调控CD8 T细胞抗肿瘤免疫的免疫检查点，SSRIs是靶向瘤内5-羟色胺轴用于T细胞癌症免疫治疗的有前景候选药物，并可与现有ICB疗法联用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SSRI处理对多种同系肿瘤模型的抗肿瘤效果评估
评估SSRI阻断SERT在肿瘤预防和治疗中的效果。
使用FLX或CIT处理多种同系小鼠肿瘤模型，监测肿瘤生长和动物生存，流式检测CD8 T细胞效应功能。
Sert-KO及骨髓移植实验验证SERT的免疫细胞内在作用
确定SERT是否以免疫细胞内在方式调控抗肿瘤免疫。
比较Sert-WT和Sert-KO小鼠B16-OVA肿瘤生长，并进行骨髓移植实验，流式检测CD8 T细胞数量和效应分子。
CD8 T细胞清除及过继转移实验验证CD8 T细胞依赖性
验证SSRI的抗肿瘤效果依赖于CD8 T细胞，并测试SERT在抗原特异性T细胞中的作用。
在Sert-WT小鼠中清除CD8 T细胞后给予FLX治疗；将OT1/WT或OT1/KO T细胞过继转移至荷瘤CD45.1小鼠。
体外CD8 T细胞抗原反应及自分泌5-羟色胺信号机制研究
研究SERT对CD8 T细胞抗原反应的自主调控及自分泌5-羟色胺信号通路。
纯化Sert-WT和Sert-KO CD8 T细胞，抗CD3刺激，检测增殖和效应分子；在缺5-羟色胺培养基中给予SSRI和5-HTR拮抗剂，检测IL-2、IFN-γ表达及信号通路磷酸化。
瘤内和血清5-羟色胺水平检测
验证SERT调控体内瘤内5-羟色胺可用性。
在Sert-KO BMT和SSRI处理的B16-OVA荷瘤小鼠中，用HPLC检测肿瘤和血清5-羟色胺水平。
人CD8 T细胞实验及人源化异种移植模型验证
评估SSRI对人CD8 T细胞抗肿瘤反应的增强作用及临床相关性。
体外刺激健康供者PBMC来源的naive CD8 T细胞并给予SSRI，检测增殖和效应分子；在NSG小鼠中建立A375-A2-ESO-FG或PC3-A2-ESO-FG肿瘤，过继转移ESO-T细胞后给予FLX治疗。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| SSRI处理 | 盐酸氟西汀 | Abcam | ab120077 |
| 西酞普兰 | Abcam | ab120133 | |
| MAOI处理 | 硫酸苯乙肼 | Sigma-Aldrich | P6777 |
| 5-HTR拮抗 | 阿塞那平 | Sigma-Aldrich | A7861 |
| 5-HTR2B拮抗 | RS-127445 | Sigma-Aldrich | R2533 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | 10040 |
| DMEM培养基 | Corning | 10013 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Gibco | 10378016 | |
| T细胞刺激 | 纯化抗小鼠CD3ε抗体（克隆145-2C11） | BD Biosciences | 553057 |
| 纯化抗小鼠CD28抗体（克隆37.51） | BD Biosciences | 553294 | |
| 人T细胞刺激 | 抗人CD3抗体（克隆HIT3a） | BioLegend | 300314 |
| 抗人CD28抗体（克隆CD28.2） | BioLegend | 302902 | |
| T细胞培养 | 重组人IL-2 | PeproTech | 200-02 |
| CD8 T细胞清除 | 抗小鼠CD8α体内抗体（克隆RMP2.43） | BioXCell | BE0061 |
| PD-1阻断 | 抗小鼠PD-1体内抗体（克隆RMP1-14） | BioXCell | BE0146 |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料eFluor 506 | Thermo Fisher Scientific | 65-0866 |
| 细胞固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| Foxp3/转录因子染色试剂盒 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| OVA dextramer | Immudex | JD2163 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| miRNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | 217004 | |
| SuperScript III第一链合成预混液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 18080400 | |
| SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725271 | |
| Western blot | RIPA裂解提取缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| 核蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | P178833 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23228 and 1859078 | |
| 抗小鼠NF-κB p65抗体（克隆D14E12） | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| 抗小鼠c-Jun抗体（克隆60A8） | Cell Signaling Technology | 9165S | |
| 抗小鼠NFAT抗体 | Cell Signaling Technology | 4389S | |
| 抗小鼠ERK1/2抗体（克隆3A7） | Cell Signaling Technology | 9107S | |
| 抗小鼠磷酸化ERK1/2抗体（克隆D13.14.4E） | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| GAPDH抗体（克隆14C10） | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| Lamin A/C抗体（克隆3A6-4C11） | Active Motif | 39287 | |
| ECL prime蛋白质印迹检测系统 | Cytiva | RPN2232 | |
| ELISA | 5-羟色胺超敏ELISA试剂盒 | Eagle Biosciences | SEU39-K01 |
| 小鼠抗dsDNA ELISA试剂盒 | BioVendor | 637-02691 | |
| 细胞分选 | 小鼠naive CD8 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-543 |
| 小鼠CD8 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| 人naive CD8 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-093-244 | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v2 | 10x Genomics | PN-120237 |
| NovaSeq 6000 S2试剂盒 | Illumina | 20012862 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SSRI体内处理 | SSRI种类、剂量、给药途径和频率：fluoxetine 10 mg/kg/day或citalopram 30 mg/kg/day，腹腔注射 阅读提示：STAR Methods中Syngeneic mouse tumor models小节 |
| 抗PD-1联合治疗 | 抗PD-1抗体剂量和频率：300 μg/只，每周两次腹腔注射；同型对照为rat IgG2a 阅读提示：STAR Methods中Syngeneic mouse tumor models小节 |
| CD8 T细胞清除 | 抗CD8抗体剂量和频率：200 μg/只，每周两次腹腔注射；同型对照为rat IgG2b 阅读提示：STAR Methods中Syngeneic mouse tumor models小节 |
| 肿瘤接种 | 各肿瘤模型细胞接种数量：B16-OVA 1×10^6/只，MC38 5×10^5/只，4T1原位1×10^4/只，A375-A2-ESO-FG 10×10^6/只，PC3-A2-ESO-FG 5×10^6/只 阅读提示：STAR Methods中Syngeneic mouse tumor models和Xenograft human tumor models小节 |
| 体外SSRI处理 | SSRI体外浓度：fluoxetine 2 μM，citalopram 20 μM；抗CD3 5 μg/ml，抗CD28 1 μg/ml 阅读提示：STAR Methods中In vitro mouse CD8 T cell culture和In vitro human CD8 T cell culture小节 |
| 自分泌5-羟色胺信号阻断 | 5-HTR拮抗剂浓度：ASE 10 μM，RS-127445 1 μM；缺5-羟色胺培养基制备方法 阅读提示：STAR Methods中In vitro mouse CD8 T cell culture小节 |
| 骨髓移植 | 骨髓细胞数量10×10^6/只，受体照射剂量1100 rads，抗生素水处理4周 阅读提示：STAR Methods中Bone marrow (BM) transfer B16-OVA tumor model小节 |
| OT1 T细胞过继转移 | OT1 T细胞数量1×10^5/只，受体照射剂量600 rads，肿瘤预先接种1周 阅读提示：STAR Methods中Adoptive OT1 T cell transfer B16-OVA tumor model小节 |