I型干扰素响应性小胶质细胞塑造皮层发育与行为

Type-I-interferon-responsive microglia shape cortical development and behavior.

作者信息Caroline C Escoubas, Leah C Dorman, Phi T Nguyen, Christian Lagares-Linares, Haruna Nakajo, Sarah R Anderson, Jerika J Barron, Sarah D Wade, Beatriz Cuevas, Ilia D Vainchtein, Nicholas J Silva, Ricardo Guajardo, Yinghong Xiao, Peter V Lidsky, Ellen Y Wang, Brianna M Rivera, Sunrae E Taloma, Dong Kyu Kim, Elizaveta Kaminskaya, Hiromi Nakao-Inoue, Bjoern Schwer, Thomas D Arnold, Ari B Molofsky, Carlo Condello, Raul Andino, Tomasz J Nowakowski, Anna V Molofsky

PMID38490196

期刊Cell

发布时间2024-04-11

DOI10.1016/j.cell.2024.02.020

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实验完整度

高

包含体外原代小胶质细胞吞噬实验、小鼠条件敲除与IFN-β注射模型、斑马鱼活体成像及行为学验证

主要模型

小鼠部分触须剥夺模型（P2 cauterize 40% whisker follicles） Ifnar1全局及条件敲除小鼠（Cx3cr1CRE、P2ry12CreERT2、Syn1CRE）原代小鼠小胶质细胞体外吞噬实验斑马鱼幼虫视顶盖活体成像模型

重点核对

部分触须剥夺模型：P2 cauterize 40% whisker follicles，P5/P7取材 Ifnar1条件敲除效率：Cx3cr1CRE降低小胶质细胞IFNAR1蛋白77%，P2ry12CreERT2降低48% IFN-β脑室内注射：10 ng IFN-β或PBS，P4注射，P5取材斑马鱼poly(I:C)注射：2 nL 1 mg/mL poly(I:C)或PBS，注射后4小时活体成像流式细胞术和免疫染色定量小胶质细胞IFITM3+比例、泡状小胶质细胞比例及53BP1+ foci神经元比例

摘要

小胶质细胞是脑内驻留的巨噬细胞，塑造神经回路发育并与神经发育疾病相关。多种小胶质细胞转录状态已被定义，但其功能意义尚不清楚。在此，我们在发育中的体感皮层（出生后第5天）鉴定出一种I型干扰素（IFN-I）响应性小胶质细胞状态，该状态正在活跃地吞噬整个神经元。该群体在部分触须剥夺诱导的皮层重塑过程中扩增。全局或小胶质细胞特异性缺失IFN-I受体导致小胶质细胞出现吞噬溶酶体功能障碍，并伴有核DNA损伤的神经元积累。IFN-I功能获得增加了小鼠和斑马鱼中小胶质细胞对神经元的吞噬，并限制了DNA损伤神经元的积累。最后，IFN-I缺陷导致皮层兴奋性神经元过多和触觉超敏。这些数据定义了神经元吞噬性小胶质细胞在大脑发育关键窗口中的作用，并揭示了经典抗病毒信号通路在大脑中的稳态功能。

建立部分触须剥夺诱导皮层重塑模型

探究小胶质细胞是否响应神经回路结构重排

P2小鼠麻醉后切断B和D排触须毛囊并硝酸银烧灼，P5/P7取体感皮层，检测VGLUT2桶状结构、TUNEL和53BP1。

单细胞转录组鉴定IFN-I响应性小胶质细胞状态

分子定义皮层重塑下小胶质细胞响应状态

P2触须剥夺后P5和P7分离CD11b+细胞进行10x单细胞RNA测序，聚类和差异表达分析。

验证IFN-I响应性小胶质细胞的形态和吞噬功能

表征IFN-I响应性小胶质细胞是否吞噬神经元

IFITM3免疫染色结合Cx3cr1GFP、Mx1GFP、RorbcreTdT、Aldh1l1TdT和Grin1 RNAscope，共聚焦成像和三维重建分析吞噬杯和吞噬溶酶体。

IFN-I信号缺失对小鼠小胶质细胞和神经元的影响

确定IFN-I信号是否必需

使用Ifnar1−/−、Cx3cr1CRE:Ifnar1flox/flox、P2ry12CreERT2:Ifnar1flox/flox和Syn1CRE:Ifnar1flox/flox小鼠，定量泡状小胶质细胞和53BP1+ foci神经元。

核酸感知通路对IFN-I响应性小胶质细胞的影响

确定上游核酸感知通路

使用Mavs−/−、Cgas−/−和Tlr3−/−小鼠，检测IFITM3+小胶质细胞、泡状小胶质细胞和53BP1+ foci神经元。

IFN-I功能获得促进神经元吞噬

测试IFN-I是否足以诱导神经元吞噬性小胶质细胞

P4小鼠脑室内注射10 ng IFN-β或PBS，P5检测IFITM3+小胶质细胞、吞噬杯和53BP1+ foci；AAV-Syn1:Ifnb1过表达；斑马鱼注射poly(I:C)后活体成像。

IFN-I对皮层神经元组成和触觉行为的影响

评估IFN-I信号对皮层发育和感觉行为的影响

P15定量CTIP2+、Parvalbumin+、Somatostatin+、GAD67+神经元密度；P15进行whisker nuisance行为学测试。

实验环节	名称	品牌	货号
免疫组织化学	兔抗IFITM3抗体	Proteintech	11714-1-AP
大鼠抗CD68抗体	Bio-Rad	MCA1957GA
兔抗53BP1抗体	Novus Biologicals	NB100-304
兔抗Iba1抗体	Wako Chemicals	019-19741
豚鼠抗VGLUT2抗体	Synaptic Systems	135404
大鼠抗CTIP2抗体	Biolegend	650601
小鼠抗小清蛋白抗体	Sigma-Aldrich	P3088
兔抗SATB2抗体	Abcam	ab92446
TSA Plus Cyanine 3检测试剂盒	Akoya Biosciences	NEL744001KT
TUNEL染色	DeadEnd荧光TUNEL系统	Promega	G3250
荧光原位杂交	RNAscope多重荧光试剂盒v2	Advanced Cell Diagnostics	323100
小鼠Grin1 RNAscope探针	Advanced Cell Diagnostics	431611
小鼠Ifnar1 RNAscope探针	Advanced Cell Diagnostics	512971-C2
脑室内注射	重组IFN-β	R&D Systems	8234-MB-010/CF
斑马鱼注射	高分子量聚肌胞苷酸	Invivogen	tlrl-pic
原代小胶质细胞培养	聚肌胞苷酸	Invivogen	tlrl-pic
流式细胞术	PE标记大鼠抗CD11b抗体	eBioscience	12-0112-81
APC标记大鼠抗CD11b抗体	BioLegend	101212
PE标记小鼠抗IFNAR1抗体	Biolegend	127311
溶酶体染色	溶酶体红色探针	Thermo Fisher	L7528
诱导凋亡细胞	ABT-263（Navitoclax）	MedChemExpress	HY-10087
诱导CreER活性	他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648
单细胞RNA测序	Chromium单细胞基因表达平台v3	10x Genomics	1000075

实验环节

名称

品牌

货号

免疫组织化学

兔抗IFITM3抗体

Proteintech

11714-1-AP

大鼠抗CD68抗体

Bio-Rad

MCA1957GA

兔抗53BP1抗体

Novus Biologicals

NB100-304

兔抗Iba1抗体

Wako Chemicals

019-19741

豚鼠抗VGLUT2抗体

Synaptic Systems

135404

大鼠抗CTIP2抗体

Biolegend

650601

小鼠抗小清蛋白抗体

Sigma-Aldrich

P3088

兔抗SATB2抗体

Abcam

ab92446

TSA Plus Cyanine 3检测试剂盒

Akoya Biosciences

NEL744001KT

TUNEL染色

DeadEnd荧光TUNEL系统

Promega

G3250

荧光原位杂交

RNAscope多重荧光试剂盒v2

Advanced Cell Diagnostics

323100

小鼠Grin1 RNAscope探针

Advanced Cell Diagnostics

431611

小鼠Ifnar1 RNAscope探针

Advanced Cell Diagnostics

512971-C2

脑室内注射

重组IFN-β

R&D Systems

8234-MB-010/CF

斑马鱼注射

高分子量聚肌胞苷酸

Invivogen

tlrl-pic

原代小胶质细胞培养

聚肌胞苷酸

Invivogen

tlrl-pic

流式细胞术

PE标记大鼠抗CD11b抗体

eBioscience

12-0112-81

APC标记大鼠抗CD11b抗体

BioLegend

101212

PE标记小鼠抗IFNAR1抗体

Biolegend

127311

溶酶体染色

溶酶体红色探针

Thermo Fisher

L7528

诱导凋亡细胞

ABT-263（Navitoclax）

MedChemExpress

HY-10087

诱导CreER活性

他莫昔芬

Sigma-Aldrich

T5648

单细胞RNA测序

Chromium单细胞基因表达平台v3

10x Genomics

1000075

环节	核对要点
部分触须剥夺模型	烧灼触须毛囊排（B和D排，约40%）、手术日龄（P2）、取材时间（P5和P7）、麻醉和镇痛方式阅读提示：Methods 'Whisker lesions'小节及Figure 1A
他莫昔芬诱导P2ry12CreERT2	他莫昔芬剂量（每日50μg）、注射日龄（P1、P3、P4）、给药途径（intra-gastric）阅读提示：Methods 'Tamoxifen injections'小节及Figure 5C、5D
IFN-β脑室内注射	IFN-β剂量（10 ng）、注射体积（2 μL）、注射日龄（P4）、取材时间（P5，注射后24小时）、坐标阅读提示：Methods 'Interferon β injection'小节及Figure 6A
斑马鱼poly(I:C)注射与活体成像	poly(I:C)浓度（1 mg/mL）、注射体积（2 nL）、注射日龄（7 dpf）、成像时间（注射后4小时）、成像间隔（5分钟）阅读提示：Methods 'Poly(I:C) microinjection into zebrafish larvae'和'Zebrafish Live imaging'小节及Figure 6P
原代小胶质细胞吞噬实验	小胶质细胞来源（P2-P4 Ifnar1+/+或Ifnar1−/−）、接种密度（20,000 cells/well）、poly(I:C)浓度（6 μg/mL）、凋亡细胞比例（1:2）、成像间隔（每小时，共24小时）阅读提示：Methods 'Primary microglia culture and engulfment assay'小节及Figure S4G-S4M
Whisker nuisance行为学测试	测试日龄（P15）、刺激次数（3次，每次2分钟）、评分标准（0-10分）、盲法评分阅读提示：Methods 'Behavioral assay – Whisker nuisance test'小节及Figure 7J-7M

环节

核对要点

部分触须剥夺模型

烧灼触须毛囊排（B和D排，约40%）、手术日龄（P2）、取材时间（P5和P7）、麻醉和镇痛方式

阅读提示：Methods 'Whisker lesions'小节及Figure 1A

他莫昔芬诱导P2ry12CreERT2

他莫昔芬剂量（每日50μg）、注射日龄（P1、P3、P4）、给药途径（intra-gastric）

阅读提示：Methods 'Tamoxifen injections'小节及Figure 5C、5D

IFN-β脑室内注射

IFN-β剂量（10 ng）、注射体积（2 μL）、注射日龄（P4）、取材时间（P5，注射后24小时）、坐标

阅读提示：Methods 'Interferon β injection'小节及Figure 6A

斑马鱼poly(I:C)注射与活体成像

poly(I:C)浓度（1 mg/mL）、注射体积（2 nL）、注射日龄（7 dpf）、成像时间（注射后4小时）、成像间隔（5分钟）

阅读提示：Methods 'Poly(I:C) microinjection into zebrafish larvae'和'Zebrafish Live imaging'小节及Figure 6P

原代小胶质细胞吞噬实验

小胶质细胞来源（P2-P4 Ifnar1+/+或Ifnar1−/−）、接种密度（20,000 cells/well）、poly(I:C)浓度（6 μg/mL）、凋亡细胞比例（1:2）、成像间隔（每小时，共24小时）

阅读提示：Methods 'Primary microglia culture and engulfment assay'小节及Figure S4G-S4M

Whisker nuisance行为学测试

测试日龄（P15）、刺激次数（3次，每次2分钟）、评分标准（0-10分）、盲法评分

阅读提示：Methods 'Behavioral assay – Whisker nuisance test'小节及Figure 7J-7M

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