AMOT凝聚物形成与细胞密度响应
验证AMOT是否响应细胞-细胞接触形成生物分子凝聚物。
在MDCK细胞表达CFP-AMOT，比较低密度与高密度培养下的亚细胞定位；用CFP-AMOTΔAB、CFP-AMOTS175E、CFP-AMOTΔCC及HA-CFP-AMOT敲入HEK293A细胞验证；FRAP和融合实验检测液态性质。
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多相凝聚介导Hippo通路激活
Multiphase coalescence mediates Hippo pathway activation.
实验完整度
高体外纯化蛋白LLPS重建、细胞系活细胞成像、敲除/敲低功能回补、蛋白互作分析及果蝇组织验证
主要模型
MDCK细胞 HEK293A/HEK293细胞 果蝇翅成虫盘 纯化重组蛋白体外LLPS体系
重点核对
高密度培养或0.4 M山梨醇处理诱导凝聚物的时间进程（30分钟与90分钟） AMOT/KIBRA双缺失或SLMAP敲除细胞中YAP磷酸化及定位的回复实验 FRAP检测凝聚物液态性质及荧光恢复半衰期 纯化蛋白浓度、NaCl浓度及PEG-8000对体外LLPS的影响 KIBRA-SLMAP与SIKE-SLMAP竞争性结合的His-tag pulldown/Co-IP
摘要
生物分子凝聚物的功能常受凝聚物溶解的限制。凝聚物是否能在不溶解的情况下被抑制尚不清楚。本研究表明，Hippo信号通路的上游调控因子形成功能拮抗的凝聚物，它们凝聚成一个共同相，提供了一种在不溶解凝聚物的情况下抵消生物分子凝聚物功能的模式。具体而言，负调控因子SLMAP形成使Hippo失活的凝聚物，以促进STRIPAK复合物对通路的抑制。响应细胞-细胞接触或渗透压应激，正调控因子AMOT和KIBRA形成激活Hippo的凝聚物，以促进通路激活。功能拮抗的SLMAP和AMOT/KIBRA凝聚物进一步凝聚成一个共同相，以抑制STRIPAK功能。这些发现为在不溶解凝聚物的情况下限制生物分子凝聚物的活性提供了范例，揭示了多相组织的分子原理，并为理解Hippo信号通路的上游调控提供了概念框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Hippo通路上游调控因子如何响应细胞-细胞接触和渗透压等信号协同调控核心激酶级联，以及凝聚物功能能否在不溶解的情况下被抑制。
- 核心机制
- AMOT和KIBRA形成Hippo激活型凝聚物，SLMAP形成Hippo抑制型凝聚物；AMOT/KIBRA双支架凝聚物与SLMAP凝聚物多相凝聚为三支架凝聚物，通过竞争性排除SIKE使SLMAP失活，从而增强Hippo通路激活。
- 主要证据
- 体外纯化蛋白重建多相凝聚及核心激酶组分分配、MDCK和HEK293A细胞活细胞成像与FRAP、AMOT/KIBRA或SLMAP缺失细胞中YAP磷酸化和定位回补实验、His-tag pulldown和Co-IP分析蛋白互作。
- 研究意义
- 提供了在不溶解凝聚物的情况下限制凝聚物活性的范例，揭示了多相组织的分子原理，并为理解Hippo信号通路上游调控提供了概念框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AMOT体外LLPS重建及F-actin调控
在纯化体系中重建AMOT相分离并检验F-actin的影响。
纯化重组CFP-AMOT及突变体，稀释至指示浓度诱导LLPS；加入预聚合F-actin观察AMOT分布；FRAP比较F-actin上与游离AMOT动态。
KIBRA渗透压响应凝聚物形成
验证KIBRA是否响应渗透压应激发生LLPS。
纯化YFP-KIBRA及ΔCC突变体进行体外LLPS；MDCK细胞表达YFP-KIBRA，用0.4 M山梨醇或200 mM NaCl处理并移除；FLAG-YFP-KIBRA敲入HEK293A验证；FRAP和融合实验。
AMOT/KIBRA双支架凝聚物体外与细胞内验证
检验AMOT与KIBRA能否共相分离形成双支架凝聚物并富集激酶级联组分。
混合纯化CFP-AMOT与YFP-KIBRA，或混合预形成凝聚物观察凝聚；在CFP-AMOT敲入HEK293A细胞表达YFP-KIBRA，高密度或0.4 M山梨醇诱导；检测MST/SAV、LATS/MOB、YAP富集。
SLMAP凝聚物形成及MST失活功能
验证SLMAP是否组成型形成凝聚物并促进MST去磷酸化。
纯化CFP-SLMAP及ΔCC进行体外LLPS；MDCK细胞低密度表达CFP-SLMAP观察凝聚；检测MST和SIKE富集及ER共定位；SLMAP敲除HEK293A细胞中回补并检测MOB T35磷酸化。
KIBRA-SLMAP双相凝聚及AMOT诱导三相凝聚
解析KIBRA与SLMAP形成双相凝聚物的条件及AMOT促进其凝聚为单相的机制。
纯化YFP-KIBRA与CFP-SLMAP按不同摩尔比混合观察双相凝聚；加入递增AMOT观察相凝聚；混合预形成AMOT/KIBRA与SLMAP凝聚物；His-tag pulldown和Co-IP比较同型与异型互作强度。
细胞内三相凝聚物诱导及功能回补
验证渗透压或高密度能否在细胞内诱导AMOT/KIBRA/SLMAP三相凝聚物并增强Hippo激活。
MDCK或HEK293细胞经0.4 M山梨醇处理30分钟和90分钟，或高密度培养，免疫荧光和活细胞成像观察凝聚物时序；AMOT敲除或KIBRA敲除细胞表达野生型或突变体，检测YAP磷酸化、YAP定位及靶基因。
核心激酶级联组分在三相凝聚物中的分配及SIKE排除
确定双相与三相凝聚物对MST、LATS、YAP及SIKE的分配差异。
体外重建双相KIBRA-SLMAP和三相AMOT/KIBRA/SLMAP凝聚物，加入MST/SAV、LATS/MOB、YAP或SIKE检测富集；MDCK细胞0.4 M山梨醇30/90分钟验证体内分配；His-tag pulldown检测KIBRA对SLMAP-SIKE互作的竞争。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | 30230 |
| 体外LLPS | 聚乙二醇8000 | Sigma | 89510 |
| 渗透压应激处理 | D-山梨醇 | Sigma | S1876 |
| 体外F-actin重建 | 兔肌肉G-肌动蛋白 | Cytoskeleton | AKL99 |
| Alexa Fluor 568鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| 活细胞F-actin标记 | SiR-肌动蛋白试剂盒（Cy5-F-肌动蛋白） | Cytoskeleton | CY-SC001 |
| 免疫荧光 | DRAQ5荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | 62251 |
| 内质网红色荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | E34250 | |
| 内质网绿色荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | E34251 | |
| Co-IP | 小鼠IgG磁珠 | Cell Signaling Technology | 5873 |
| 小鼠FLAG磁珠 | Sigma | M8823 | |
| 质粒构建 | Q5热启动高保真预混液 | New England BioLabs | M0494 |
| NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | New England BioLabs | E2621 | |
| RNA提取与RT-qPCR | RNeasy Plus迷你试剂盒 | Qiagen | 74136 |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 14368814 | |
| RT-qPCR | iQ SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1708886 |
| 活细胞成像 | 35 mm玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-14-C |
| 35 mm玻璃底培养皿（多聚-D-赖氨酸包被） | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| 蛋白纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 5056489001 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | 4906837001 | |
| Western blot | 兔多克隆抗GFP抗体 | MBL International | 598 |
| 兔多克隆抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 鼠单克隆抗V5标签抗体 | Thermo Fisher Scientific | R960-25 | |
| 大鼠单克隆抗FLAG抗体 | BioLegend | 637302 | |
| 鼠单克隆抗FLAG-HRP抗体 | Sigma | A8592 | |
| 兔多克隆抗YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| 兔多克隆抗磷酸化YAP（Ser127）抗体 | Cell Signaling Technology | 4911 | |
| 兔多克隆抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 兔单克隆抗磷酸化MOB（Thr35）抗体 | Cell Signaling Technology | 8699 | |
| 兔多克隆抗MOB抗体 | Cell Signaling Technology | 3863 | |
| 鼠单克隆抗GAPDH抗体 | Sigma | MAB374 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞密度与渗透压诱导凝聚物 | 低密度0.4×10^6与高密度2×10^6接种24小时；0.4 M山梨醇或200 mM NaCl处理时间（30/90分钟） 阅读提示：Methods“Cell-cell contact and osmotic stress induction”及Figure 2C、6A图注 |
| 体外LLPS重建 | 蛋白浓度、终NaCl浓度150 mM、3% PEG-8000（仅SLMAP）、缓冲液pH 7.5 阅读提示：Methods“In vitro liquid-liquid phase separation (LLPS) assay”及图1G、2A、4A图注 |
| 敲除/敲低与回补实验 | AMOT/KIBRA双缺失细胞构建方式（AMOT三敲除+siRNA敲低KIBRA/WWC2/WWC3）；SLMAP敲除细胞；回补所用野生型及ΔCC/mPY/ΔWW突变体 阅读提示：Results“AMOT and KIBRA form bi-scaffold condensates”及“SLMAP forms biomolecular condensates”段落；Key Resources Table |
| YAP磷酸化与定位检测 | YAP S127磷酸化Western blot；高密度下YAP定位评分标准（N=C为弥散，N<C为主要胞质）；每组至少200细胞，n=3 阅读提示：Figure 3F、3G、6C、6E图注及Methods“Immunofluorescence staining” |
| 蛋白互作强度比较 | His-tag pulldown与Co-IP中同型/异型互作比较条件；AMOT递增浓度对KIBRA-SLMAP互作的影响 阅读提示：Figure 5D–F及Figure S5、S7F图注 |