人类遗传关联分析
验证GPR146变异与血浆胆固醇水平的关联及其对表达的影响
分析rs1997243与血浆TC、HDL-C、LDL-C的GWAS关联，并在2,116份人血样本中进行eQTL分析GPR146表达
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GPR146缺陷可预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化
GPR146 Deficiency Protects against Hypercholesterolemia and Atherosclerosis.
实验完整度
高含人类遗传关联、多种基因敲除小鼠模型、体外细胞实验、转录组分析及机制验证，覆盖多层级证据。
主要模型
Gpr146全身敲除小鼠（Gpr146−/−） LDLR缺陷小鼠（Ldlr−/−）及Gpr146−/−Ldlr−/−双敲小鼠 肝细胞特异性Gpr146敲除小鼠（Alb-Cre+Gpr146fl/fl） 人肝癌细胞系Huh7和HepG2
重点核对
小鼠年龄、性别和饮食：6–36周龄雌雄小鼠，喂食普通饲料、高脂饮食（60%脂肪，TD.06414，3周）或西方饮食（TD.10885，2周或16周） Gpr146基因敲除策略：CRISPR/Cas9构建全身敲除和floxed小鼠，肝细胞特异性敲除用Alb-Cre，脂肪细胞特异性敲除用Adipoq-Cre VLDL分泌率检测：禁食4小时后腹腔注射Poloxamer-407 1 g/kg体重，在0、60、120分钟检测血浆TC和TG MEK抑制剂PD0325901体内处理：5 mg/kg或10 mg/kg体重，腹腔注射，每日一次，处理14天或单次剂量 AAV8-shRNA敲低：8周龄Ldlr−/−小鼠眶后静脉注射，雄性6×10^11 gc、雌性4×10^11 gc，注射后2、4、6周采血
摘要
尽管人类遗传学研究已发现许多与血浆脂质水平相关的易感基因，但其生理和分子功能尚未完全阐明。在此，我们证明孤儿G蛋白偶联受体146（GPR146）通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路促进肝脏固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）的活性，从而调节肝脏极低密度脂蛋白（VLDL）分泌，进而影响循环低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平。值得注意的是，GPR146缺陷可显著降低野生型和LDL受体（LDLR）缺陷小鼠的血浆胆固醇水平。最后，在LDLR缺陷小鼠中敲除GPR146后，雄性和雌性小鼠的主动脉粥样硬化病变分别减少90%和70%。综上所述，这些发现揭示了GPR146/ERK轴在全身胆固醇代谢中的调节作用，并提示抑制GPR146可能是降低血浆胆固醇水平和动脉粥样硬化的有效策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GPR146是否以及如何调节全身胆固醇代谢，其缺陷能否预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化？
- 核心机制
- GPR146通过激活肝细胞ERK1/2信号通路促进SREBP2活性，进而增加肝脏VLDL分泌速率和血浆LDL-C/TG水平；该调控不依赖LDLR活性。
- 主要证据
- 在Gpr146−/−小鼠中血浆TC降低20–25%，VLDL分泌率下降，肝脏成熟SREBP2和pERK1/2降低；在Ldlr−/−背景下Gpr146缺陷使WD喂养16周后雄性/雌性主动脉病变分别减少约90%和70%；MEK抑制剂PD0325901在野生型小鼠中降低血浆TC约22%，在Gpr146−/−小鼠中无额外效果。
- 研究意义
- 提示抑制GPR146可能是降低血浆胆固醇和动脉粥样硬化的有效策略，尤其可能适用于缺乏有效药物治疗的HoFH患者。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Gpr146基因敲除小鼠构建与基础表型
建立全身及条件性敲除模型并检测Gpr146组织表达和血浆脂质变化
用CRISPR/Cas9构建Gpr146−/−和Gpr146fl/fl小鼠，检测组织mRNA，并检测不同年龄、性别和饮食条件下血浆TC、TG及FPLC脂蛋白分布
肝脏VLDL分泌率及组织特异性敲除验证
确定GPR146缺陷降低血浆胆固醇是否源于肝脏VLDL分泌减少及肝细胞GPR146的作用
用Poloxamer-407检测VLDL分泌率；构建Alb-Cre+和Adipoq-Cre+条件敲除小鼠检测血浆TC和VLDL分泌
体外肝细胞GPR146功能验证
验证GPR146直接调节肝细胞APOB100分泌和ERK1/2活性
在Huh7中CRISPR敲除GPR146或过表达GPR146检测APOB100分泌和LDL摄取；在HepG2中过表达GPR146检测pERK1/2
肝脏转录组与SREBP2/ERK通路分析
揭示GPR146缺陷下调肝脏胆固醇合成和MAPK信号的分子机制
对再喂食小鼠肝脏进行微阵列和GSEA分析；用qRT-PCR和Western blot检测SREBP2及其靶基因、pERK1/2水平
ERK1/2通路药理学和遗传学验证
验证GPR146通过ERK1/2调控SREBP2和血浆胆固醇
体外用MEK抑制剂PD0325901或CRISPR敲除ERK1/ERK2检测SREBP2靶基因；体内用PD0325901处理Gpr146+/+和Gpr146−/−小鼠检测血浆TC和肝脏基因表达
LDLR缺陷背景下的代谢与动脉粥样硬化验证
验证GPR146缺陷的降胆固醇和抗动脉粥样硬化作用不依赖LDLR
构建Gpr146−/−Ldlr−/−小鼠，检测普通饲料和WD 16周后血浆TC、TG、脂蛋白分布及主动脉Oil Red O染色病变面积；检测肝脏pERK1/2和SREBP2
AAV8-shRNA急性敲低肝GPR146
验证成年Ldlr−/−小鼠中急性敲低肝脏GPR146的降脂效果
8周龄Ldlr−/−小鼠眶后静脉注射AAV8-scramble或AAV8-Gpr146-shRNA，检测血浆TC、TG、脂蛋白分布和肝脏胆固醇合成基因
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证遗传关联与表达
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑小鼠构建 | Cas9 mRNA | -- | -- |
| sgRNA | -- | -- | |
| 供体寡核苷酸 | -- | -- | |
| 小鼠饲养与饮食干预 | 高脂饲料（60%脂肪，TD.06414） | Envigo | TD.06414 |
| 西方饮食饲料（TD.10885） | Envigo | TD.10885 | |
| qPCR检测Gpr146 mRNA | Taqman探针 Mm01951835_s1 | Life Technologies | Mm01951835_s1 |
| Western blot | 小鼠单克隆抗HSP90抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13119 |
| 小鼠单克隆抗APOB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393636 | |
| 兔单克隆抗p44/42 MAPK（Erk1/2）抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 兔单克隆抗p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 兔多克隆抗SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 兔单克隆抗磷酸化p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 兔多克隆抗磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 | |
| 兔单克隆抗磷酸化SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 兔单克隆抗HMGCS1抗体 | Cell Signaling Technology | 42201 | |
| 兔多克隆抗SREBP2抗体 | Abcam | Ab30682 | |
| 兔多克隆抗HMGCR抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5–37367 | |
| 兔多克隆抗LDLR抗体 | Sigma-Aldrich | HPA013159 | |
| 小鼠单克隆抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 | |
| 小鼠单克隆抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| AAV敲低 | AAV8-GFP-U6-乱序shRNA | Vector Biolabs | -- |
| AAV8-GFP-U6-小鼠Gpr146-shRNA | Vector Biolabs | -- | |
| MEK抑制剂体内外处理 | PD0325901 | Selleckchem | S1036 |
| VLDL分泌检测 | 泊洛沙姆407 | Sigma-Aldrich | 16758 |
| LDL摄取检测 | 人血浆来源Dil标记低密度脂蛋白 | Thermo Fisher Scientific | L3482 |
| 血浆TG检测 | Infinity甘油三酯试剂 | Thermo Fisher Scientific | TR22421 |
| 血浆TC检测 | Infinity胆固醇试剂 | Thermo Fisher Scientific | TR13421 |
| 脂蛋白分离 | HDL和LDL/VLDL定量试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK045–1KT |
| APOB100分泌检测 | 人ApoB ELISAPRO试剂盒 | Mabtech | 3715–1HP-2 |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | -- | -- |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| HEK293T转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 慢病毒感染 | lentiCas9-Blast质粒 | Addgene | 52962 |
| lentiGuide-Puro质粒 | Addgene | 52963 | |
| FU-tetO-Gateway质粒 | Addgene | 43914 | |
| 细胞培养 | 多西环素 | -- | -- |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- | |
| 反转录 | Maxima H Minus cDNA合成系统 | Thermo | -- |
| qPCR | ViiA™ 7实时PCR系统 | Applied Biosystems Inc. | -- |
| RNA质量检测 | Agilent生物分析仪 | Agilent | -- |
| 6000 nano试剂盒 | Agilent | -- | |
| 微阵列分析 | Affymetrix GeneChip™小鼠基因2.1 ST阵列条 | Affymetrix | -- |
| 粪便脂质提取 | Folch提取法 | -- | -- |
| 粪便/肝脏脂质检测 | SpeedVac真空浓缩仪 | -- | -- |
| 肝脏脂质提取 | 氯仿-甲醇 | -- | -- |
| 动脉粥样硬化病变染色 | 油红O溶液 | -- | -- |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| 福尔马林 | -- | -- | |
| 成像与量化 | ImageJ | NIH | -- |
| MEK抑制剂体内处理 | 羟丙甲纤维素 | -- | -- |
| Tween-80 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与饮食 | 小鼠年龄（6–36周）、性别、饲料类型（普通饲料、HFD TD.06414 3周、WD TD.10885 2周或16周）及禁食/再喂食时间（16小时禁食、6小时再喂食） 阅读提示：STAR Methods中Mice小节及图注Figure 1、2、6 |
| VLDL分泌率检测 | Poloxamer-407剂量1 g/kg体重、腹腔注射、检测时间点0/60/120分钟、禁食4小时 阅读提示：STAR Methods中Hepatic VLDL secretion assay |
| MEK抑制剂PD0325901体内处理 | 剂量5 mg/kg或10 mg/kg体重、腹腔注射每日一次、处理14天或单次剂量、溶剂组成（0.5% hypromellose和0.2% Tween-80） 阅读提示：STAR Methods中MEK1 inhibitor treatment及图注Figure 4J–4L、S4M–S4R |
| AAV8-shRNA敲低 | AAV8-Gpr146-shRNA剂量雄性6×10^11 gc、雌性4×10^11 gc，眶后静脉注射，注射后2/4/6周采血，WD开始时间2周后 阅读提示：STAR Methods中In vivo knockdown of hepatic Gpr146 using AAV-delivered shRNA |
| 动脉粥样硬化病变定量 | 7周龄Ldlr−/−小鼠WD喂养16周、主动脉整体Oil Red O染色、病变面积以全长主动脉管腔面积百分比表示、盲法量化 阅读提示：STAR Methods中En Face quantification of Atherosclerotic lesions in the aorta及图注Figure 6I–6N |
| 体外细胞实验 | 细胞系Huh7/HepG2/AML12、血清饥饿时间（Huh7/HepG2 48小时，AML12 24小时无胰岛素）、PD0325901浓度1 μM预处理1小时、血清刺激终浓度20% 阅读提示：STAR Methods中MEK1 inhibitor treatment及Cell Lines, Culture Conditions小节 |