患者队列蛋白质组学分析
鉴定与免疫治疗应答相关的蛋白质网络和功能通路。
对116例黑色素瘤FFPE样本进行SILAC内标定量LC-MS/MS蛋白质组学分析，比较应答者与非应答者的差异表达蛋白和通路富集。
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黑色素瘤对免疫治疗应答的蛋白质组学揭示线粒体依赖性
Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence.
实验完整度
高包含患者样本蛋白质组学、细胞系代谢扰动/CRISPR敲除、体外T细胞杀伤及小鼠移植瘤模型等多层级功能验证。
主要模型
116例IV期黑色素瘤患者FFPE组织样本（TIL队列42例，抗PD1队列74例） 黑色素瘤细胞系WM266-4、Mel526、Mel76、Mel04等 小鼠黑色素瘤细胞系YUMMER1.7（克隆D4J）及C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
患者分组：应答者（部分或完全缓解）与非应答者（进展性疾病），PD1队列另含稳定疾病患者7例 代谢扰动处理：DCA 30 mM处理72小时；avasimibe 3 μM、etomoxir 100 μM、rotenone 200 nM、antimycin 250 nM或oligomycin 50 nM处理72小时 CRISPR-Cas9敲除基因：ACAT1、HADHA、CPT1A（人细胞系）及Acat1（小鼠细胞系） T细胞杀伤实验：效应细胞TIL14与靶细胞按10:1比例共培养18小时，LDH释放检测 小鼠体内实验：YUMMER1.7（D4J）细胞1×10^5皮下注射C57BL/6小鼠，对照组n=8，Acat1 KO组n=10，监测17天
摘要
免疫治疗革新了癌症治疗，但大多数患者不应答。在此，我们通过分析接受肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或抗程序性死亡1（PD1）免疫治疗的晚期黑色素瘤患者的临床样本蛋白质组，研究了应答机制。使用高分辨率质谱，我们在每个数据集中总共定量了超过10,300种蛋白质，在大多数样本中定量了约4,500种蛋白质。统计分析显示，在两种治疗中，应答者的氧化磷酸化和脂质代谢均高于非应答者。为了阐明代谢状态对免疫应答的影响，我们检查了经代谢扰动或CRISPR-Cas9敲除的黑色素瘤细胞。这些实验表明脂质代谢作为一种调节机制，通过提高抗原呈递来增加黑色素瘤免疫原性，从而在体外和体内均增加对T细胞介导杀伤的敏感性。总之，我们的蛋白质组学分析揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗应答之间的关联，这可以作为未来改善治疗应答的基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在通过蛋白质组学分析，揭示晚期黑色素瘤患者对TIL或抗PD1免疫治疗应答的分子特征和细胞机制。
- 核心机制
- 黑色素瘤细胞的线粒体代谢状态（氧化磷酸化和脂质代谢）通过调节抗原呈递机制（包括MHC I类分子和抗原加工相关蛋白）来影响肿瘤免疫原性，从而改变对T细胞杀伤的敏感性。
- 主要证据
- 对116例患者样本的蛋白质组学分析显示应答者线粒体代谢和抗原呈递蛋白富集；DCA处理增加HLA呈递；ACAT1、HADHA或CPT1A敲除降低MHC I表达和T细胞杀伤；小鼠体内Acat1敲除促进肿瘤生长并减少细胞因子产生T细胞。
- 研究意义
- 研究揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗应答之间的关联，为未来改善治疗应答提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
应答相关蛋白标志物鉴定与验证
筛选最小蛋白质特征集并验证其与患者生存的关联。
使用SVM分类器筛选TIL和抗PD1队列的蛋白质特征，通过ROC曲线评估预测性能，并用Kaplan-Meier分析关联无进展生存期。
组织水平验证代谢蛋白与T细胞浸润
在组织水平确认代谢蛋白在黑色素瘤细胞中的表达及其与T细胞浸润的相关性。
对TIL队列的连续切片进行免疫组化染色，检测ACAT1、ACOT1、HADHA、MITF、SDHA、FABP7及CD3、CD8，量化染色并分析相关性。
代谢扰动对黑色素瘤细胞抗原呈递的影响
验证线粒体代谢变化是否功能性地调节抗原呈递。
用DCA处理四种黑色素瘤细胞系，进行蛋白质组学分析、流式细胞术检测HLA表面表达和RT-qPCR检测HLA mRNA；并用线粒体抑制剂处理观察相反效应。
CRISPR-Cas9敲除代谢基因对免疫原性的影响
确定特定代谢蛋白（ACAT1、HADHA、CPT1A）在调节抗原呈递和T细胞杀伤中的作用。
在WM266-4和Mel526细胞中敲除ACAT1、HADHA或CPT1A，进行蛋白质组学分析、流式细胞术检测MHC表达、MitoTracker染色、Seahorse耗氧率测定，并与匹配T细胞共培养检测杀伤。
小鼠体内验证Acat1敲除对肿瘤生长和免疫微环境的影响
在体内验证Acat1敲除对黑色素瘤生长和抗肿瘤免疫应答的影响。
将Acat1敲除的YUMMER1.7（D4J）细胞和对照细胞皮下注射到C57BL/6小鼠，监测肿瘤生长17天，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞和MHC表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学样本制备 | 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5113 |
| LysC胰蛋白酶混合液 | Promega | V5071 | |
| SILAC标记 | Arg10-13C615N4 | Cambridge Isotopes Laboratories | CNLM-539 |
| Lys8-13C615N2 | Cambridge Isotopes Laboratories | CNLM-291 | |
| 细胞培养 | SILAC DMEM培养基 | Biological Industries | 06-1055-70-1 |
| SILAC RPMI培养基 | Biological Industries | 06-1100-28-1 | |
| 药物处理 | 寡霉素 | Sigma-Aldrich | 04876 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 阿伐麦布 | APEXBIO | A4318 | |
| 乙莫克舍 | Sigma-Aldrich | E1905 | |
| 流式分析 | 小鼠抗人HLA-DR抗体（克隆G46-6，APC偶联） | BD Biosciences | 560896 |
| 小鼠抗人HLA-ABC抗体（克隆G46-2.6，FITC偶联） | BD Biosciences | 555552 | |
| 免疫组化 | ACAT1免疫组化抗体 | Atlas Antibodies | HPA007569 |
| ACOT1免疫组化抗体 | Atlas Antibodies | HPA043705 | |
| HADHA免疫组化抗体 | GeneTex | GTX113727 | |
| SDHA免疫组化抗体 | Cell Signaling Technology | 11998 | |
| FABP7免疫组化抗体 | Atlas Antibodies | HPA028825 | |
| MITF免疫组化抗体 | Cell Marque | 284M-96 | |
| CD8免疫组化抗体 | Biocare Medical | CRM311 | |
| CD3免疫组化抗体 | Dako | A0452 | |
| 流式分析 | H2-kb/H2kd抗体 | Biolegend | 114612 |
| PDL1抗体 | Biolegend | 124314 | |
| CD4抗体 | BD Biosciences | 564298 | |
| CD8抗体 | BD Biosciences | 563786 | |
| CD45抗体 | Biolegend | 103147 | |
| CD11B抗体 | Biolegend | 101226 | |
| F4/80抗体 | Biolegend | 123110 | |
| Ly6C抗体 | Biolegend | 128032 | |
| TNFA抗体 | Biolegend | 506306 | |
| IFNG抗体 | Biolegend | 505826 | |
| 蛋白质组学样本制备 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| 逆转录 | QScript cDNA合成试剂盒 | Quantabioscience | 95047 |
| 线粒体染色 | MitoTracker® Deep Red FM线粒体深红色荧光探针 | Thermo Scientific | M22426 |
| T细胞杀伤实验 | CytoTox-ONE均质膜完整性检测试剂盒 | Promega | G7891 |
| 流式分析 | LIVE/DEAD™可固定红色死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher | L23102 |
| 免疫组化 | Bond Polymer Refine Red Detection Novocastra试剂盒 | Leica Biosystems | DS9390 |
| Seahorse分析 | Seahorse XFe96 FluxPak试剂盒 | Agilent | 102416-100 |
| 样本制备 | 30 kDa Amicon过滤器 | Millipore | UFC803024 |
| 细胞培养 | 96孔玻璃底板 | Cellvis | P96-1.5H-N |
| 蛋白质组学样本制备 | Empore十八烷基C18 47mm萃取盘 | Sigma-Aldrich | 66883-U |
| Empore阳离子47mm萃取盘 | Sigma-Aldrich | 66889-U | |
| Empore阴离子SR 47mm萃取盘 | Sigma-Aldrich | 66888-U | |
| 液相色谱 | 50 cm EASY-spray PepMap色谱柱 | Thermo Scientific | ES803 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列蛋白质组学 | 样本来源：Sheba医学中心FFPE组织；分组标准：RECIST v1.0；应答者n=61，非应答者n=48，PD1队列稳定疾病n=7；蛋白质定量阈值：至少70%样本中鉴定 阅读提示：STAR Methods中Tumor sample collection及Proteomics sample preparation小节；Figure 1A和Table S1A |
| 代谢扰动实验 | DCA浓度30 mM，处理72小时；抑制剂浓度：avasimibe 3 μM、etomoxir 100 μM、rotenone 200 nM、antimycin 250 nM、oligomycin 50 nM；细胞系：WM266-4、Mel526、Mel76、Mel04 阅读提示：STAR Methods中Cell lines小节及Figure 6和图S6图注 |
| CRISPR-Cas9敲除 | gRNA序列选择及验证；转染后嘌呤霉素筛选2-4周；敲除验证通过质谱分析；细胞系：WM266-4、Mel526、YUMMER1.7（D4J） 阅读提示：STAR Methods中CRISPR-Cas9 gene knockout小节及Figure S7、S8图注 |
| T细胞杀伤实验 | 靶细胞1×10^4，效应细胞TIL14，效靶比10:1，共培养18小时；LDH释放检测使用CytoTox-ONE试剂盒 阅读提示：STAR Methods中T cell killing assay小节及Figure 7A图注 |
| 小鼠体内实验 | 细胞注射量1×10^5/100 μL PBS皮下；小鼠品系C57BL/6；对照组n=8，Acat1 KO组n=10；监测17天；肿瘤消化使用胶原酶IV和DNase 阅读提示：STAR Methods中Tumor growth assessment and tumor digestion小节及Figure 7B-7N图注 |
| 免疫组化 | 抗体来源和货号见KEY RESOURCES TABLE；染色平台：BOND-RX或Benchmark XT；每组染色肿瘤块数量：代谢蛋白4-5个（SDHA 10个），CD3/CD8 5-6个；定量算法：Aperio Cytoplasmic或Membrane Algorithm 阅读提示：STAR Methods中Immunohistochemistry (IHC) staining小节及Figure 5图注 |