建立患者来源膀胱癌类器官生物样本库
从患者肿瘤样本中建立可长期培养的类器官系，以代表膀胱癌的临床和病理多样性。
从TURBT或膀胱切除术获取新鲜肿瘤组织，经胶原酶/透明质酸酶和TrypLE消化后，与60% Matrigel混合培养于含EGF、CS-FBS、Y-27632和Glutamax的肝细胞培养基中，建立并传代类器官系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
膀胱癌患者来源类器官模型中的肿瘤演化与药物反应
Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.
实验完整度
高体外类器官、原位异种移植瘤、患者样本多层级证据，含基因组、表型及药物反应功能验证
主要模型
患者来源膀胱癌类器官系（SCBO-1至SCBO-16、SMBO-1、SMBO-2） 原位异种移植瘤（NOG小鼠膀胱壁） 患者肿瘤组织样本（TURBT/膀胱切除术标本） 患者来源异种移植瘤（PDX）
重点核对
类器官系建立效率：约70%（n=12/17），成功标准为连续传代至少6次 原位异种移植瘤形成效率：83%（n=15/18），超声引导下注射1×10^6细胞于膀胱黏膜下层 靶向测序（MSK-IMPACT 468基因）显示11/22类器官系与亲本肿瘤突变谱一致性>80% 药物反应：9株类器官测试40种化合物，另11株测试10种化合物，3个生物学重复，处理6天 体内验证：trametinib口服灌胃0.5 mg/kg（用5天停2天），gemcitabine腹腔注射100 mg/kg（每周两次）
摘要
膀胱癌是美国第五大常见癌症，但研究不足，且很少有能够反映人类疾病生物学的实验室模型。本文描述了一个患者来源类器官系生物样本库，其重现了人膀胱癌的组织病理学和分子多样性。类器官系可从疾病复发前后获取的患者活检组织中高效建立，并且可与原位异种移植瘤相互转化。值得注意的是，类器官系通常保留亲本肿瘤异质性，并表现出与培养中肿瘤演化一致的基因组变化谱。使用膀胱肿瘤类器官进行的药物反应分析显示与突变谱的部分相关性以及与治疗耐药相关的改变，特定反应可在体内使用异种移植瘤进行验证。我们的研究表明，患者来源的膀胱肿瘤类器官代表了一个忠实的模型系统，用于在精准癌症医学背景下研究肿瘤演化和治疗反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 患者来源膀胱癌类器官能否忠实重现人膀胱癌的组织病理学和分子多样性，并用于研究肿瘤演化和药物反应？
- 核心机制
- 类器官在培养和异种移植过程中发生克隆演化，保留主干突变但亚克隆突变可获得或丢失；药物反应与突变谱部分相关，耐药性可在复发后建立的类器官中体现。
- 主要证据
- 22株类器官系与亲本肿瘤的组织病理学和突变谱高度一致；全外显子组测序和系统发育分析显示线性及分支演化模式；药物反应测定和体内异种移植瘤验证显示类器官培养中的反应可在体内重现。
- 研究意义
- 患者来源膀胱肿瘤类器官是研究肿瘤演化和治疗反应的忠实模型系统，可用于精准癌症医学背景下的药物反应评估和潜在联合治疗识别。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证类器官与亲本肿瘤的组织病理学和分子一致性
确认类器官系能够重现亲本肿瘤的组织学特征和突变谱。
对类器官和亲本肿瘤进行H&E染色和免疫组化/免疫荧光分析（CK7、CK5、CK8、CK20、p53、Ki67等），并使用MSK-IMPACT靶向测序（468基因）比较突变谱。
建立原位异种移植瘤并与类器官相互转化
在体内环境中验证类器官的致瘤性和组织学特征，并建立类器官与异种移植瘤之间的双向转化。
超声引导下将类器官细胞注射到NOG小鼠膀胱黏膜下层，监测肿瘤生长，并从异种移植瘤中重新建立类器官。
分析培养和异种移植过程中的肿瘤演化
评估类器官在传代和异种移植过程中的遗传稳定性及克隆演化模式。
对亲本肿瘤、早期和晚期传代类器官、异种移植瘤及异种移植瘤来源类器官进行靶向测序和全外显子组测序，分析突变等位基因频率、克隆组成、突变特征和系统发育树。
评估类器官的药物反应并与突变谱关联
测试类器官对膀胱癌相关药物的反应，并分析反应与突变谱的相关性。
对9株类器官测试40种化合物，另11株测试10种化合物，进行剂量滴定（7点5倍稀释），6天后用CellTiter-Glo 3D测定细胞活力，计算IC50、Hill slope和AUC。
在体内验证类器官药物反应
确认类器官培养中观察到的药物反应可在体内异种移植瘤中重现。
对荷瘤小鼠给予trametinib或gemcitabine治疗，通过超声监测肿瘤体积，并分析肿瘤组织学和Ki67、cleaved caspase-3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织收集和运输 | 含表皮生长因子的肝细胞培养基 | Corning | 355056 |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| Y-27632（ROCK抑制剂） | STEMCELL Technologies | 07171 | |
| 组织解离 | 胶原酶/透明质酸酶 | STEMCELL Technologies | 07912 |
| TrypLE Express解离液 | Invitrogen | 12605036 | |
| 中性蛋白酶 | STEMCELL Technologies | 07913 | |
| 类器官培养 | Primocin抗生素 | InvivoGen | ant-pm-1 |
| Glutamax添加剂 | Gibco | 35050 | |
| 组织固定和包埋 | 鼠尾胶原I | Corning | 354249 |
| 组织固定 | 10%福尔马林 | Fisher Chemical | SF100-4 |
| 免疫荧光 | 抗原修复液 | Vector Labs | H3300 |
| 含DAPI的VECTASHIELD封片剂 | Vector Labs | -- | |
| Western blot | Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78441 |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34577 | |
| 药物处理 | 曲美替尼 | Selleck Chemicals | S2673 |
| 吉西他滨 | Selleck Chemicals | S1714 | |
| AZD8055 | Cayman Chemical | 16978 | |
| JNJ-42756493 | ActiveBiochem | A-1278 | |
| 西罗莫司（雷帕霉素） | Selleck Chemicals | S1039 | |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo 3D细胞活力测定试剂盒 | Promega | G9683 |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 全外显子组测序 | SureSelect人全外显子V4捕获试剂盒 | Agilent | 5190-4668 |
| RNA提取 | MagMAX-96总RNA提取试剂盒 | Invitrogen | AM1839 |
| RNA测序文库构建 | TruSeq RNA文库构建试剂盒v2 | Illumina | RS-122-2001 |
| RNA测序 | TruSeq SBS测序试剂盒v5 | Illumina | FC-104-5001 |
| 原位异种移植 | VEVO 2100超声成像系统 | Visualsonics | -- |
| 免疫荧光 | 鸡多克隆抗CK5抗体 | BioLegend | 905901 |
| 兔单克隆抗CK7抗体 | Abcam | ab181598 | |
| 大鼠单克隆抗CK8抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | TROMA-I | |
| 兔多克隆抗CK14抗体 | BioLegend | 905301 | |
| 鼠单克隆抗CK20抗体 | Dako | M7019 | |
| 兔多克隆抗p53抗体 | Santa Cruz | SC-6243 | |
| 大鼠单克隆抗Ki67抗体 | eBioscience | 14-5698-82 | |
| 兔多克隆抗cleaved caspase 3抗体 | BD | 559565 | |
| Western blot | 兔单克隆抗磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 兔单克隆抗p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 兔单克隆抗磷酸化S6 (Ser235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 | |
| 兔单克隆抗S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官建立 | 组织来源（TURBT/膀胱切除术）、消化条件（胶原酶/透明质酸酶15分钟，TrypLE 3分钟）、Matrigel浓度60%、传代比例1:2-3 阅读提示：Methods 'Tissue dissociation and organoid culture'小节 |
| 原位异种移植 | 小鼠品系NOG、6-8周龄雄性、注射细胞数1×10^6、注射体积50 μl、Matrigel比例50%、超声引导 阅读提示：Methods 'Organoid xenograft studies'小节 |
| 药物反应测定 | 化合物浓度范围（10 μmol/l至128 pmol/l或100 μmol/l至1.28 nmol/l）、DMSO最大浓度1%、处理时间6天、三个生物学重复、CellTiter-Glo 3D测定 阅读提示：Methods 'Organoid drug response assay'小节及Figure 5、Figure S7、Figure S8 |
| 体内药物验证 | trametinib剂量0.5 mg/kg口服灌胃用5天停2天、gemcitabine剂量100 mg/kg腹腔注射每周两次、治疗起始肿瘤体积20-50 mm3、治疗2周、每组小鼠数（SCBO-6:6只，SCBO-3:4只，SCBO-5:8只） 阅读提示：Methods 'Organoid xenograft studies'小节及Figure 6 |
| 靶向测序 | MSK-IMPACT panel 468基因、测序深度约500倍、肿瘤与匹配正常血液配对测序、一致性阈值>80% 阅读提示：Methods 'Targeted sequencing'小节及Figure 2 |