脂肪细胞TBK1表达与ATKO小鼠构建
确认HFD是否诱导脂肪细胞TBK1表达并建立脂肪细胞特异性敲除模型。
检测HFD与ND喂养小鼠成熟脂肪细胞Tbk1表达；将Tbk1fl/fl小鼠与adiponectin-Cre小鼠杂交获得ATKO小鼠，检测eWAT、iWAT和肝脏Tbk1表达。
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TBK1在脂肪组织炎症与能量稳态交叉点中的作用
TBK1 at the Crossroads of Inflammation and Energy Homeostasis in Adipose Tissue.
实验完整度
高含脂肪细胞特异性TBK1/AMPK/ULK1敲除小鼠体内实验、原代脂肪细胞及MEFs体外实验，并有磷酸化位点、激酶实验和NIK敲除机制验证
主要模型
高脂饮食喂养的脂肪细胞特异性TBK1敲除（ATKO）小鼠 3T3-L1脂肪细胞 原代脂肪细胞（Flox与ATKO） HEK293T细胞及MEFs
重点核对
ATKO小鼠eWAT和iWAT中Tbk1 mRNA降低>50%，肝脏无变化 HFD喂养16周Flox与ATKO小鼠的OCR与能量消耗 TNFα（10nM）处理脂肪细胞后AMPK Thr172磷酸化变化 AMPKα1 Ser459和Ser476为TBK1磷酸化位点，SS/AA与SS/DD突变体对Thr172磷酸化的影响 AICAR（500μM或500mg/kg）经ULK1诱导TBK1 Ser172磷酸化
摘要
非经典IKK家族成员TANK结合激酶1（TBK1）可被促炎细胞因子激活，但其在代谢控制中的作用仍不清楚。本文报告该激酶独特地控制能量代谢。高脂饮食（HFD）喂养小鼠的脂肪细胞中Tbk1表达增加。脂肪细胞特异性TBK1敲除（ATKO）通过增加能量消耗减轻HFD诱导的肥胖；进一步研究表明TBK1直接抑制AMPK以抑制呼吸并增加能量储存。相反，分解代谢条件下AMPK的激活可通过AMPK下游靶点ULK1介导的磷酸化增加TBK1活性。令人意外的是，ATKO还加重脂肪组织炎症和胰岛素抵抗。TBK1通过磷酸化并诱导IKK激酶NIK降解来抑制炎症，从而减弱NFκB活性。此外，TBK1介导AMPK活性对NFκB激活的负面影响。这些数据提示TBK1在营养过剩和营养不足状态下介导能量感知与炎症信号通路之间的双向交互中具有独特作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TBK1在脂肪组织能量代谢和炎症调控中发挥什么作用及其机制。
- 核心机制
- TBK1直接磷酸化AMPKα1 Ser459/Ser476抑制AMPK活性以减少呼吸和能量消耗；AMPK经ULK1磷酸化TBK1 Ser172形成负反馈；TBK1通过磷酸化并促进NIK降解抑制NFκB，从而介导AMPK的抗炎作用。
- 主要证据
- HFD喂养ATKO小鼠能量消耗增加、肥胖减轻但炎症和胰岛素抵抗加重；脂肪细胞中TBK1缺失增强TNFα诱导的NFκB激活和Ccl2表达；质谱鉴定AMPKα1磷酸化位点，激酶实验证明ULK1直接磷酸化TBK1，NIK敲除消除TBK1缺失引起的NFκB过度激活。
- 研究意义
- 揭示TBK1在营养过剩和营养不足状态下介导能量感知与炎症信号通路的反馈及双向交互，对代谢疾病中AMPK激活剂与TBK1抑制剂联合应用具有提示意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATKO小鼠代谢表型评估
验证脂肪细胞TBK1缺失对体重、脂肪含量和能量消耗的影响。
对HFD喂养16周Flox与ATKO小鼠进行DEXA扫描、称量体重和组织重量、CLAMs间接测热测定OCR和EE。
AMPK活性与线粒体生物合成检测
探究TBK1缺失增加能量消耗是否由AMPK活性升高和线粒体生物合成增强介导。
检测脂肪细胞大小、ex vivo OCR、线粒体生物合成基因表达、MitoTracker染色、NAD/NADH比值及AMPK Thr172磷酸化；用TNFα处理3T3-L1和原代脂肪细胞检测AMPK磷酸化。
TBK1磷酸化AMPK的位点鉴定
确定TBK1是否直接磷酸化AMPKα并抑制其活性。
在HEK293T细胞共表达TBK1 WT或K38A与AMPKα1，免疫共沉淀和λ磷酸酶处理；LC-MS/MS鉴定磷酸化位点；构建SS/AA和SS/DD突变体检测Thr172磷酸化。
AMPK经ULK1激活TBK1的验证
验证AMPK激活是否通过ULK1磷酸化TBK1 Ser172。
用AICAR处理WT与AMPKα1/α2 KO MEFs、3T3-L1及ULK1 KO MEFs；使用compound C、Amlexanox、Oxozeaenol、SBI-0206965预处理；体内注射AICAR于AMPK AKO和ULK1 AKO小鼠；体外激酶实验检测ULK1磷酸化TBK1。
ATKO小鼠糖耐量与胰岛素抵抗评估
检测脂肪细胞TBK1缺失对HFD诱导的葡萄糖稳态和胰岛素敏感性的影响。
进行GTT、ITT、体内2-[C14]-脱氧葡萄糖摄取和胰岛素刺激Akt磷酸化检测。
脂肪组织炎症与NFκB通路分析
探究TBK1缺失加重胰岛素抵抗是否与脂肪组织炎症和NFκB激活增强相关。
检测巨噬细胞标志基因、H&E和F4/80染色、SVF流式分析、Ccl2和Tnfa表达；检测p52、p105磷酸化及NIK敲除对NFκB激活和Ccl2表达的影响。
AMPK抗炎作用依赖TBK1的验证
验证TBK1是否介导AMPK激活对NFκB的抑制作用。
在3T3-L1、原代脂肪细胞及TBK1 KO MEFs中先用AICAR预处理再以TNFα刺激，检测p105、IKKα/β磷酸化和Ccl2表达；在TBK1 KO MEFs中回补TBK1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞处理 | 重组小鼠TNFα | Thermo Scientific | PMC3014 |
| 氨来呫诺 | Abcam | ab142825 | |
| 细胞与动物处理 | AICAR | Cell Signaling Technology | 9944 |
| 细胞处理 | Compound C | Calbiochem | 171260 |
| SBI-0206965 | Sigma-Aldrich | SML1540 | |
| 5Z-7-Oxozeaenol | Sigma-Aldrich | O9890 | |
| 蛋白降解检测 | MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| 蛋白提取 | 蛋白酶抑制剂片 | Sigma-Aldrich | 11873580001 |
| 体内葡萄糖摄取 | 2-[C14]-脱氧葡萄糖 | PerkinElmer | NEC720A250UC |
| 体外激酶实验 | ULK1活性激酶 | Signal Chem | U01-11G-10 |
| Western blot | TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013 |
| 磷酸化TBK1 Ser172抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 磷酸化AMPKα Thr172抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| p100/p52抗体 | Cell Signaling Technology | 4882 | |
| 磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 2078 | |
| p105抗体 | Cell Signaling Technology | 4717 | |
| 磷酸化p105 Ser933抗体 | Cell Signaling Technology | 4806 | |
| ULK1抗体 | Cell Signaling Technology | 8054 | |
| NIK抗体 | Cell Signaling Technology | 4994 | |
| ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3662 | |
| 磷酸化ACC Ser79抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| MAPK（Erk1/2）抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 | |
| 免疫沉淀与Western blot | Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 |
| Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 血清胰岛素检测 | 超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Crystal Chem | 90080 |
| 血清甘油三酯检测 | 甘油三酯液体试剂 | Pointe Scientific | T7532 |
| 血清非酯化脂肪酸检测 | NEFA-HR(2)检测 | Wako | 434-91795 434-91995 |
| cAMP测定 | 环磷酸腺苷XP检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | 4339 |
| 离体脂解测定 | 游离甘油测定试剂盒 | Sigma-Aldrich | F6428 |
| 离体耗氧率测定 | 细胞外耗氧检测 | Abcam | ab197243 |
| NAD/NADH比值测定 | NAD/NADH检测试剂盒 | Abcam | ab65348 |
| AMP测定 | AMP-Glo检测 | Promega | V6930 |
| ADP测定 | ADP-Glo检测 | Promega | V5011 |
| ATP测定 | ENLITEN ATP检测 | Promega | PAFF2000 |
| 高脂饮食喂养 | 高脂饮食（45%千卡来自脂肪） | Research Diet, Inc. | D12451 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与饮食 | 小鼠品系为C57BL/6J雄性，6–8周龄开始HFD（45% kcal脂肪，D12451）喂养12–16周；Flox与KO为同窝同笼 阅读提示：STAR Methods中Animals小节 |
| 代谢表型检测 | CLAMs间接测热法和DEXA扫描；OCR和EE样本量N=5–6；检测时间点 阅读提示：Figure 1 legend及STAR Methods中Animals小节 |
| 细胞处理与AMPK磷酸化 | TNFα浓度10nM、处理时间（30min至8hr）；低糖DMEM饥饿条件；AICAR浓度250–500μM及预处理7hrs 阅读提示：Figure 2、Figure 4、Figure 7 legends |
| 体内AICAR注射 | AICAR 500mg/kg腹腔注射45min；AMPKα1/α2 AKO和ULK1 AKO小鼠12–14周龄 阅读提示：Figure 4 legend及STAR Methods |
| 葡萄糖与胰岛素耐量试验 | HFD小鼠GTT葡萄糖1.2g/kg BW、ITT胰岛素1.2U/kg BW；HFD喂养12周；采血时间点15–120min 阅读提示：Figure 5 legend及STAR Methods中Glucose tolerance test和Insulin tolerance test小节 |
| 体内葡萄糖摄取 | 禁食16hrs；注射1.2g/kg葡萄糖、1U/kg胰岛素和180μCi/kg 2-[C14]-脱氧葡萄糖；60min取材 阅读提示：Figure 5 legend及STAR Methods中In vivo 2-[C14]-deoxyglucose uptake小节 |
| NFκB与NIK机制实验 | TNFα 10nM处理45min或5nM处理16hrs；NIK CRISPR/Cas9 gRNA序列；MG132处理条件 阅读提示：Figure 6 legend及STAR Methods中Generation of NIK knockout MEFs小节 |