宿主-微生物共代谢决定秀丽隐杆线虫中的抗癌药物疗效

Host-Microbe Co-metabolism Dictates Cancer Drug Efficacy in C. elegans.

作者信息Timothy A Scott, Leonor M Quintaneiro, Povilas Norvaisas, Prudence P Lui, Matthew P Wilson, Kit-Yi Leung, Lucia Herrera-Dominguez, Sonia Sudiwala, Alberto Pessia, Peter T Clayton, Kevin Bryson, Vidya Velagapudi, Philippa B Mills, Athanasios Typas, Nicholas D E Greene, Filipe Cabreiro

PMID28431245

期刊Cell

发布时间2017-04

DOI10.1016/j.cell.2017.03.040

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实验完整度

高

结合大肠杆菌Keio基因敲除文库三方高通量筛选、线虫表型验证、LC-MS/MS代谢物检测及体内肿瘤/寿命模型，含功能与机制验证。

主要模型

秀丽隐杆线虫N2 Bristol及突变体大肠杆菌BW25113及Keio单基因敲除文库大肠杆菌OP50、HB101、HT115等菌株 gld-1 RNAi和glp-1(gof)线虫肿瘤模型

重点核对

线虫卵孵化MIC测定：5-FU浓度梯度0-64 μM，至少3个独立生物学重复，每数据点至少100只动物宿主-微生物-药物筛选：3813个Keio敲除株，初筛0/1/2.5/5 μM 5-FU，复筛0-100 μM，3个生物学重复细菌生长IC50：96孔板OD600nm，37°C 180 rpm 16 hr，log(inhibitor) vs response四参数模型 LC-MS/MS代谢物检测：细菌/线虫/卵样本，至少3-4个生物学重复，稳定同位素内标定量寿命分析：gld-1 RNAi或glp-1(gof)线虫，25°C，每4天转板，每1-2天评分，log-rank检验

摘要

氟尿嘧啶类药物是结直肠癌的一线治疗药物，但其疗效在患者间差异很大。我们探究了作为个体间差异已知来源的肠道微生物是否影响药物疗效。结合两种易处理的遗传模型——大肠杆菌和秀丽隐杆线虫，我们进行了三方高通量筛选，揭示了宿主-微生物-药物相互作用的复杂性。我们报道，微生物可以通过涉及细菌维生素B6、B9和核糖核苷酸代谢的代谢性药物互变来增强或抑制氟尿嘧啶类药物的效果。此外，细菌脱氧核苷酸池的紊乱会放大宿主细胞中5-FU诱导的自噬和细胞死亡，这一效应受核苷二磷酸激酶ndk-1调控。我们的数据提示细菌对氟尿嘧啶类宿主代谢效应存在双向介导，这有助于药物疗效。这些发现凸显了操纵肠道微生物群以确保宿主代谢健康和治疗疾病的潜在治疗能力。

建立线虫-细菌-药物三方模型并比较菌株效应

验证不同细菌菌株是否影响氟尿嘧啶对线虫的疗效。

将线虫饲养于不同大肠杆菌实验室菌株和野生型菌株上，测定5-FU及其他氟尿嘧啶类药物对卵孵化的MIC；并比较热/UV灭活细菌、细菌生长和细菌药物敏感性与宿主药效的关系。

高通量宿主-微生物-药物筛选鉴定细菌调控基因

系统鉴定影响5-FU对宿主疗效的大肠杆菌基因。

使用Keio单基因敲除文库进行初筛和复筛，以线虫发育停滞的MIC为读出；同时进行微生物-药物筛选测定细菌生长；进行KEGG/EcoCyc通路富集分析。

验证维生素B6代谢对5-FU疗效的调控

确定细菌PLP合成通路是否介导5-FU对宿主的疗效。

测试B6从头合成和补救途径基因敲除对线虫MIC的影响；用LC-MS/MS测定B6维他命水平；补充PL或PN等前体进行回补实验；用RNAi敲低线虫F57C9.1。

验证一碳代谢和叶酸代谢的介导作用

探究细菌甘氨酸裂解系统和叶酸代谢是否调节5-FU疗效。

测试gcvTHP、gcvA、gcvR、folM、purU、fau、metF等敲除对线虫MIC的影响；LC-MS/MS测定叶酸代谢物和多聚谷氨酸化谱；使用二甲双胍进行化学干预。

验证细菌核糖核苷酸代谢对氟尿嘧啶的生物转化

确定细菌是否通过代谢转化氟尿嘧啶前药来影响宿主疗效。

进行生物转化实验，将5-FC或5-FO与细菌预孵育后用于线虫孵化实验；LC-MS/MS检测氟核苷酸；测试Δupp、Δudk、Δudp、ΔpyrE、ΔpyrF、ΔcodA等突变体及尿苷/乳清酸/胸苷补充。

验证细菌脱氧核苷酸失衡对宿主自噬和细胞死亡的影响

探究ndk和dcd突变增强5-FU疗效的机制及其与宿主ndk-1的关系。

测试Δndk、Δdcd、ΔyjjG对线虫MIC、细菌IC50、氟核苷酸水平、自噬报告基因和msh-6突变体反应的影响；用RNAi敲低线虫ndk-1。

评估5-FU对肿瘤样生殖腺和寿命的体内效应

验证细菌代谢是否影响5-FU的抗增殖和延长寿命效应。

使用gld-1 RNAi或glp-1(gof)线虫模型，测量肿瘤大小和寿命；比较对照细菌与Δupp、ΔudpΔudkΔupp、ΔpyrE等突变体的效应。

实验环节	名称	品牌	货号
药物处理	5-氟尿嘧啶	Sigma-Aldrich	F6627
5-氟-2′-脱氧尿苷	Alfa Aesar	L1497
5-氟胞嘧啶	Acros Organics	258340010
5-氟乳清酸	ThermoFisher Scientific	R0811
卡培他滨	Santa Cruz Biotechnology	SC-205618
LC-MS/MS	氘代3-磷酸吡哆醛	Buchem BV	--
氘代3-吡哆醛	Sigma-Aldrich	705187
氘代2-吡哆醇	CDN Isotopes	D-6819
氘代3-吡哆胺	Sigma-Aldrich	705322
胞苷-13C9,15N3 5′三磷酸	Sigma-Aldrich	645699
尿苷-13C9,15N2 5′-三磷酸	Santa Cruz Biotechnology	SC-301963A
蛋白定量	Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒	ThermoFisher Scientific	23250
RNA定量	Qubit® RNA HS测定试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q32852
蛋白定量	Qubit®蛋白测定试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q33211
质粒提取	GenElute质粒小量提取试剂盒	Sigma-Aldrich	PLN70
RNA提取	Direct-zol RNA小量制备试剂盒	Zymo Research	R2052
RT-qPCR	iScript逆转录预混液	Bio-Rad	1708841
PrecisionPLUS 2X qPCR预混液	PrimerDesign	PrecisionPLUS-R-SY
分子克隆	Phusion高保真DNA聚合酶	ThermoFisher Scientific	F530S

实验环节

名称

品牌

货号

药物处理

5-氟尿嘧啶

Sigma-Aldrich

F6627

5-氟-2′-脱氧尿苷

Alfa Aesar

L1497

5-氟胞嘧啶

Acros Organics

258340010

5-氟乳清酸

ThermoFisher Scientific

R0811

卡培他滨

Santa Cruz Biotechnology

SC-205618

LC-MS/MS

氘代3-磷酸吡哆醛

Buchem BV

氘代3-吡哆醛

Sigma-Aldrich

705187

氘代2-吡哆醇

CDN Isotopes

D-6819

氘代3-吡哆胺

Sigma-Aldrich

705322

胞苷-13C9,15N3 5′三磷酸

Sigma-Aldrich

645699

尿苷-13C9,15N2 5′-三磷酸

Santa Cruz Biotechnology

SC-301963A

蛋白定量

Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒

ThermoFisher Scientific

23250

RNA定量

Qubit® RNA HS测定试剂盒

ThermoFisher Scientific

Q32852

蛋白定量

Qubit®蛋白测定试剂盒

ThermoFisher Scientific

Q33211

质粒提取

GenElute质粒小量提取试剂盒

Sigma-Aldrich

PLN70

RNA提取

Direct-zol RNA小量制备试剂盒

Zymo Research

R2052

RT-qPCR

iScript逆转录预混液

Bio-Rad

1708841

PrecisionPLUS 2X qPCR预混液

PrimerDesign

PrecisionPLUS-R-SY

分子克隆

Phusion高保真DNA聚合酶

ThermoFisher Scientific

F530S

环节	核对要点
线虫培养与药物处理	线虫饲养温度20°C（除非另有说明）；药物处理时25°C；氟尿嘧啶浓度范围0.01-64 μM；核苷酸补充200 μM或2 mM；B6维他命补充10 μM或1 mM。阅读提示：STAR Methods中Nematode Culture Conditions小节。
宿主-微生物-药物高通量筛选	使用Keio文库奇数编号敲除株；初筛5-FU浓度0、1、2.5、5 μM；复筛浓度0、5、10、15、20、30、40、50、75、100 μM；复筛3个生物学重复；每孔约10只L1线虫；25°C孵育72 hr；排除标准：NGM上不生长、无药物时线虫发育延迟、靶基因未敲除。阅读提示：STAR Methods中Host-Microbe-Drug Screen小节及Figure 2C、Figure S2C。
卵孵化实验	12孔板；线虫从L1在测试细菌上20°C培养2天；每孔2只L4线虫；25°C产卵24 hr后移除成虫；再孵育24 hr后评分；至少3个独立生物学重复，每数据点至少100只动物。阅读提示：STAR Methods中Hatching Assays小节。
细菌生长与IC50测定	细菌过夜培养后洗涤，OD600nm=2，在96孔板中1:1000稀释于含系列药物浓度的NGM肉汤；37°C 180 rpm孵育16 hr；OD600nm读取；四参数log(inhibitor) vs response模型计算IC50。阅读提示：STAR Methods中Bacterial MIC Assays小节。
LC-MS/MS代谢物分析	细菌样本：20°C NGM上生长3天的菌苔；线虫样本：约1000-5000只同步化L1在20°C培养至L4；卵样本：约5000只1日龄成虫碱性次氯酸盐处理；至少3-4个生物学重复；使用稳定同位素内标；蛋白浓度归一化。阅读提示：STAR Methods中1-Carbon Metabolism Analysis、Vitamin B6 Analysis、Nucleotide and Fluoronucleotide Analysis小节。
寿命分析	gld-1 RNAi或glp-1(gof)线虫；25°C全程；每4天转至新板；每1-2天监测存活；无肿瘤性生殖腺的动物在第1天移除；统计采用log-rank检验。阅读提示：STAR Methods中Lifespan Analysis小节。
RNAi实验	线虫在含1 mM IPTG的NGM板上用HT115(DE3)或HT115(DE3) Δndk表达pL4440 RNAi构建体维持两代；敲低效率用qRT-PCR验证。阅读提示：STAR Methods中Nematode Culture Conditions小节及Figures S3D、S6I。

环节

核对要点

线虫培养与药物处理

线虫饲养温度20°C（除非另有说明）；药物处理时25°C；氟尿嘧啶浓度范围0.01-64 μM；核苷酸补充200 μM或2 mM；B6维他命补充10 μM或1 mM。

阅读提示：STAR Methods中Nematode Culture Conditions小节。

宿主-微生物-药物高通量筛选

使用Keio文库奇数编号敲除株；初筛5-FU浓度0、1、2.5、5 μM；复筛浓度0、5、10、15、20、30、40、50、75、100 μM；复筛3个生物学重复；每孔约10只L1线虫；25°C孵育72 hr；排除标准：NGM上不生长、无药物时线虫发育延迟、靶基因未敲除。

阅读提示：STAR Methods中Host-Microbe-Drug Screen小节及Figure 2C、Figure S2C。

卵孵化实验

12孔板；线虫从L1在测试细菌上20°C培养2天；每孔2只L4线虫；25°C产卵24 hr后移除成虫；再孵育24 hr后评分；至少3个独立生物学重复，每数据点至少100只动物。

阅读提示：STAR Methods中Hatching Assays小节。

细菌生长与IC50测定

细菌过夜培养后洗涤，OD600nm=2，在96孔板中1:1000稀释于含系列药物浓度的NGM肉汤；37°C 180 rpm孵育16 hr；OD600nm读取；四参数log(inhibitor) vs response模型计算IC50。

阅读提示：STAR Methods中Bacterial MIC Assays小节。

LC-MS/MS代谢物分析

细菌样本：20°C NGM上生长3天的菌苔；线虫样本：约1000-5000只同步化L1在20°C培养至L4；卵样本：约5000只1日龄成虫碱性次氯酸盐处理；至少3-4个生物学重复；使用稳定同位素内标；蛋白浓度归一化。

阅读提示：STAR Methods中1-Carbon Metabolism Analysis、Vitamin B6 Analysis、Nucleotide and Fluoronucleotide Analysis小节。

寿命分析

gld-1 RNAi或glp-1(gof)线虫；25°C全程；每4天转至新板；每1-2天监测存活；无肿瘤性生殖腺的动物在第1天移除；统计采用log-rank检验。

阅读提示：STAR Methods中Lifespan Analysis小节。

RNAi实验

线虫在含1 mM IPTG的NGM板上用HT115(DE3)或HT115(DE3) Δndk表达pL4440 RNAi构建体维持两代；敲低效率用qRT-PCR验证。

阅读提示：STAR Methods中Nematode Culture Conditions小节及Figures S3D、S6I。

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