小分子降解剂的合成与筛选
发现能降解靶蛋白的抗病毒小分子
设计合成Nucleozin与沙利度胺类似物偶联的PROTAC库，利用NS1-GFP PR8病毒筛选出FM-74-103。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用小分子和病毒RNA模拟物促进的靶向蛋白降解生成宿主导向型和病毒特异性抗病毒药物
Generation of host-directed and virus-specific antivirals using targeted protein degradation promoted by small molecules and viral RNA mimics.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代细胞、肺类器官、多种病毒感染模型及机制验证（降解、泛素化、siRNA、抑制剂等）
主要模型
A549细胞（IAV感染） A549-ACE2细胞（SARS-CoV-2感染） ARPE-19细胞（CMV感染） 人胚胎干细胞来源的肺类器官
重点核对
化合物浓度：1 μM（除特别注明外），处理时间：感染前3小时至感染后24小时 病毒感染复数（MOI）= 1 siRNA转染浓度100 nM，转染48小时或72小时 蛋白降解验证：Western blot检测GSPT1、eRF1、eIF2α等 病毒滴度测定：空斑实验
摘要
靶向蛋白降解（TPD），以蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）为代表，是一个新兴的药物发现平台。PROTAC分子通常包含一个靶蛋白配体和一个E3连接酶配体，将靶蛋白招募到E3连接酶，诱导其泛素化并降解。在这里，我们应用PROTAC方法开发了针对许多病毒关键宿主因子的广谱抗病毒药物和针对独特病毒蛋白的病毒特异性抗病毒药物。对于宿主导向的抗病毒药物，我们鉴定了一个小分子降解剂FM-74-103，它选择性降解人GSPT1（一个翻译终止因子）。FM-74-103关闭翻译起始，抑制RNA和DNA病毒。在病毒特异性抗病毒药物中，我们开发了基于病毒RNA寡核苷酸的双功能分子（Destroyers）。作为原理验证，病毒启动子序列的RNA模拟物被用作异双功能分子，以招募和靶向流感病毒聚合酶进行降解。这项工作突出了TPD在合理设计和开发下一代抗病毒药物中的广泛用途。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用靶向蛋白降解（TPD）策略开发宿主导向和病毒特异性的抗病毒药物？
- 核心机制
- 小分子降解剂FM-74-103通过招募CRBN E3连接酶选择性降解宿主翻译终止因子GSPT1，进而抑制翻译起始，发挥广谱抗病毒作用；基于病毒RNA模拟物的Destroyers分子招募E3连接酶VHL至病毒聚合酶，诱导其降解，实现病毒特异性抗病毒。
- 主要证据
- 在多种细胞系和肺类器官中，FM-74-103降解GSPT1并抑制IAV、SARS-CoV-2和CMV复制；Destroyers（RNA3-A/RNA4-A）在体外结合病毒聚合酶并诱导其降解，抑制IAV复制。
- 研究意义
- 证明了TPD策略可用于合理设计和开发下一代抗病毒药物，既可靶向宿主因子实现广谱抗病毒，也可靶向病毒蛋白实现病毒特异性抗病毒。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FM-74-103的抗病毒活性验证
评估FM-74-103对多种病毒的抑制效果
在A549、HBTE、A549-ACE2、ARPE-19、NHDF及肺类器官中，通过空斑实验、荧光成像、Western blot等检测FM-74-103对IAV、SARS-CoV-2、CMV复制的抑制。
GSPT1降解机制验证
确认FM-74-103通过CRBN依赖的泛素-蛋白酶体途径降解GSPT1
使用siRNA敲低CRBN，蛋白酶体抑制剂MG-132、NEDD8抑制剂MLN4924等竞争实验，以及泛素化pull-down实验验证GSPT1降解途径。
GSPT1降解与抗病毒效应的因果关系验证
明确GSPT1降解及其下游eIF2α下调是抗病毒活性的原因
通过时间加入实验、洗脱实验、siRNA敲低GSPT1、ETF1、EIF2S1，以及使用CC-885等验证GSPT1降解与抗IAV活性的关系。
病毒RNA模拟物Destroyers的设计与活性验证
开发靶向病毒聚合酶的病毒特异性抗病毒分子
设计生物素标记的RNA寡核苷酸（RNA1-4），合成偶联VHL配体AHPC的Destroyers（RNA3-A、RNA4-A），通过pull-down、免疫共沉淀、流式细胞术验证其结合病毒聚合酶、招募VHL并抑制IAV复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | -- | -- | |
| 气道上皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-300-030 | |
| 支气管上皮细胞生长试剂盒 | ATCC | PCS-300-040 | |
| Ham's F-12营养混合物 | -- | -- | |
| HEPES | -- | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | -- | -- |
| mTeSR1培养基 | -- | -- | |
| TrypLE Express酶 | ThermoFisher | 12605010 | |
| 化合物处理 | Nucleozin | Sigma-Aldrich | N2790 |
| MG-132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| 来那度胺 | MedChemExpress | HY-A0003 | |
| MLN4924 | MedChemExpress | HY-70062 | |
| CC-885 | MedChemExpress | HY-101488 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher | L3000001 |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher | 13778030 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | ThermoFisher | 15596018 |
| 蛋白提取 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | ThermoFisher | 78444 |
| RNA实验 | RNase抑制剂 | ThermoFisher | AM2682 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7572 |
| MTT检测试剂盒 | Abcam | ab211091 | |
| Western blot | Western ECL底物 | Bio-Rad Laboratories | 1705061 |
| RT-PCR | iQ SYBR Green预混液 | Bio-Rad Laboratories | 1708882 |
| 空斑实验 | TrueBlue过氧化物酶底物 | SeraCare | 5510-0030 |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 逆转录 | cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher | 4368813 |
| RNA pull-down | 磁珠RNA-蛋白下拉试剂盒 | ThermoFisher | 20164 |
| 蛋白定量 | Micro BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23235 |
| Western blot | 抗GSPT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14980 |
| 抗eRF1抗体 | Cell Signaling Technology | 13916 | |
| 抗eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9722 | |
| 抗磷酸化eIF2α (Ser51)抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| 抗CRBN抗体 | Cell Signaling Technology | 71810 | |
| 抗VHL抗体 | Cell Signaling Technology | 68547 | |
| 抗ACE2抗体 | Abcam | ab108209 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗H1N1 NP抗体 | GenScript | A01506 | |
| 抗SARS-CoV-2 NP抗体 | Center for Therapeutic Antibody Development at Mount Sinai | Clone 1C7C7 | |
| 抗CMV IE1/2抗体 | Abcam | ab53495 | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗兔IgG (HRP) | Sigma-Aldrich | GENA9340 | |
| 抗鼠IgG (HRP) | Sigma-Aldrich | GENA9310 | |
| 免疫荧光 | 抗兔IgG (Alexa Fluor™ Plus 488) | ThermoFisher | A-11008 |
| 抗鼠IgG (Alexa Fluor™ Plus 488) | ThermoFisher | A-11001 | |
| siRNA | 非靶向对照siRNA池 | Horizon Discovery | D-001810-10 |
| 人CRBN siRNA池 | Horizon Discovery | L-021086-00 | |
| 人GSPT1 siRNA池 | Horizon Discovery | L-019644-00 | |
| 人ETF1 siRNA池 | Horizon Discovery | L-019840-00 | |
| 人EIF2S1 siRNA池 | Horizon Discovery | L-015389-01 | |
| 质粒 | pRK5-HA-Ub-WT质粒 | Addgene | 17608 |
| pCMV6-Entry-FLAG-GSPT1质粒 | OriGene | RC229318 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小分子降解剂FM-74-103的合成 | 合成步骤、试剂、纯化方法详见补充信息 阅读提示：补充信息中的合成细节 |
| 抗病毒活性检测（空斑实验） | 病毒MOI=1，化合物浓度1 μM，处理时间点（感染前3小时至感染后24小时），细胞类型（A549、HBTE等） 阅读提示：Methods中的Infection和Plaque assay部分；图1、3、4、5、6的图注 |
| GSPT1降解机制验证 | siRNA浓度100 nM，转染时间48小时；竞争化合物浓度10 μM预处理1小时；FM-74-103 1 μM处理6小时；MG-132 10 μM 阅读提示：Methods中的Transfection和Compound treatment部分；图2的图注 |
| 类器官实验 | 类器官培养条件（Matrigel包埋，分化天数），感染MOI=1，化合物处理浓度1 μM 阅读提示：Methods中的hPSC derived lung organoid cultures和Infection部分；图4、5的图注 |
| Destroyers的活性检测 | Destroyers浓度1 μM，转染试剂Lipofectamine RNAiMAX，感染MOI=1，MG132 100 nM 阅读提示：Methods中的Flow cytometry和RNA destroyers部分；图7的图注 |