PO-EVLPs的分离与表征
获得PO-EVLPs并明确其粒径、形态、组成和稳定性。
采用差速离心法从马齿苋中分离PO-EVLPs，通过NTA、TEM、TLC、SDS-PAGE、脂质组学、蛋白质组学和小RNA测序进行表征，并在模拟胃液和肠液中评估稳定性。
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马齿苋来源的细胞外囊泡样颗粒重编程肠道ILCs以缓解炎症性肠病和结肠炎相关结直肠癌
Portulaca oleracea L.-derived extracellular vesicle-like particles reprogram intestinal ILCs to alleviate inflammatory bowel disease and colitis-associated colorectal cancer
实验完整度
高含体外细胞实验、肠道ILC分离培养、DSS及AOM/DSS小鼠模型、生物分布及双荧光素酶验证
主要模型
DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型 慢性结肠炎小鼠模型 AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型 CT26细胞
重点核对
DSS诱导UC模型：3% DSS饮水1周；慢性结肠炎：2% DSS饮水1周+2周恢复，共3个周期 CAC模型：腹腔注射10 mg/kg AOM后，2% DSS饮水1周+2周恢复，共3个周期 PO-EVLPs灌胃剂量：30和60 mg/kg，每日给药 miR159-y agomir腹腔注射剂量：500 pmol（低剂量）或1 nmol（高剂量） 双荧光素酶报告实验：HEK-293T细胞共转染TGFBR2 3′UTR野生型/突变型质粒与miR159-y mimic或阴性对照
摘要
炎症性肠病（IBD）及其向结肠炎相关结直肠癌（CAC）的进展，因其复杂的发病机制和有限的治疗选择而构成重大临床挑战。植物来源的细胞外囊泡样颗粒（PEVLPs）因其生物相容性和内在生物活性，已成为靶向治疗的有前景候选者。在此，我们分离并表征了马齿苋来源的细胞外囊泡样颗粒（PO-EVLPs），并通过系统的生物分布研究证明其在小鼠模型结肠中的优先积累。机制上，PO-EVLPs通过递送miRNAs发挥治疗作用。具体而言，富集的miR159-y抑制TGF-β受体表达，从而促进结肠炎组织中3型固有淋巴细胞（ILC3s）的扩增。此外，在从慢性炎症向癌发生的转变过程中，miR159-y介导的TGF-β受体抑制阻止了TGF-β驱动的NK细胞向ILC1s的分化以及ILC3s向调节性固有淋巴细胞（ILCregs）的转化，从而阻碍CAC进展。体内研究还表明其具有良好的安全性。这些发现确立了PEVLPs作为一个多功能治疗平台，同时靶向炎症通路和肿瘤转化，为通过精确调节黏膜免疫来管理IBD和CAC提供了新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PO-EVLPs能否通过靶向肠道ILCs对IBD和CAC发挥双重治疗作用，其作用机制是什么。
- 核心机制
- PO-EVLPs递送miR159-y抑制TGFBR2表达，进而抑制TGF-β/Smad3信号通路；在IBD中促进ILC3扩增和IL-22产生以修复肠屏障，在CAC中阻止NK细胞向ILC1s转化及ILC3s向ILCregs转化。
- 主要证据
- DSS诱导UC和慢性结肠炎模型、AOM/DSS诱导CAC模型中PO-EVLPs灌胃改善疾病指标；结肠ILC分离培养、流式细胞术分析ILC亚群；RNA-seq和KEGG/GSEA富集分析；Western blot检测TGFBR2和p-Smad3；双荧光素酶报告验证miR159-y靶向TGFBR2 3′UTR；miR159-y agomir和antagomir体内验证。
- 研究意义
- 确立PEVLPs作为同时靶向炎症通路和肿瘤转化的多功能治疗平台，为通过精确调节黏膜免疫管理IBD和CAC提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PO-EVLPs在IBD模型中的治疗效果评价
验证PO-EVLPs对溃疡性结肠炎和慢性结肠炎的缓解作用及肠屏障修复能力。
建立DSS诱导的UC模型和慢性结肠炎模型，每日灌胃给予PO-EVLPs，检测疾病活动指数、体重、结肠病理、肠通透性、杯状细胞和Ki67等指标。
PO-EVLPs在CAC模型中的治疗效果和安全性评价
验证PO-EVLPs对结肠炎相关结直肠癌进展的抑制作用及安全性。
建立AOM/DSS诱导的CAC模型，每日灌胃PO-EVLPs，检测结肠长度、肿瘤数量、生存率、体重、组织病理及血清肝肾功能指标。
PO-EVLPs的体内生物分布和细胞摄取
明确口服后PO-EVLPs在体内的组织分布及被肠道免疫细胞摄取的情况。
采用Cy7标记PO-EVLPs灌胃，在不同时间点进行活体成像和离体器官荧光成像；采用CFSE和PKH26标记PO-EVLPs，通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测肠道免疫细胞摄取。
PO-EVLPs对肠道ILC亚群的调控
明确PO-EVLPs在UC和CAC模型中对ILC亚群组成的影响。
分离结肠固有层细胞，通过流式细胞术检测NK、ILC1、ILC2、ILC3和ILCreg比例；通过mIHC检测ILCreg。
IL-22在PO-EVLPs治疗IBD中的作用验证
验证ILC3来源的IL-22是否介导PO-EVLPs的肠屏障修复作用。
在PO-EVLPs治疗期间给予IL-22中和抗体，观察对疗效的影响，同型对照抗体作为对照。
TGF-β信号通路机制验证
验证PO-EVLPs通过下调TGFBR2抑制TGF-β信号通路，进而调控ILC表型可塑性。
对PO-EVLPs处理的肠道ILC进行RNA-seq和KEGG/GSEA分析；Western blot检测TGFBR2、Smad3和p-Smad3；分离结肠ILC，在体外用TGF-β和PO-EVLPs处理72 h，流式检测ILCreg分化和IL-22表达。
PO-EVLPs对结肠癌细胞体外的抗肿瘤作用
验证PO-EVLPs是否通过抑制TGF-β信号通路直接抑制结肠癌细胞增殖和迁移。
用不同浓度PO-EVLPs处理CT26细胞，通过MTT、Annexin V/PI凋亡、Western blot、免疫荧光、克隆形成、划痕愈合和Transwell实验检测细胞活力、凋亡、EMT标志物和迁移侵袭能力。
miR159-y作为PO-EVLPs功能成分的鉴定与验证
确定PO-EVLPs中抑制TGFBR2的关键活性成分并验证miR159-y与TGFBR2的靶向关系。
分离PO-EVLPs的脂质、蛋白、RNA和小分子组分，分别处理CT26细胞检测TGFBR2表达；对PO-EVLPs进行miRNA测序；将丰度前五的miRNA转染ILC筛选TGFBR2抑制因子；双荧光素酶报告验证miR159-y与TGFBR2 3′UTR结合；在ILC中转染miR159-y检测ILCreg分化。
miR159-y的体内治疗作用和必要性验证
验证miR159-y单独给药能否缓解结肠炎，以及抑制miR159-y是否削弱PO-EVLPs的疗效。
在结肠炎小鼠中腹腔注射miR159-y agomir，检测结肠长度、DAI、体重、HE染色、AB/PAS染色、肠屏障蛋白和ILC亚群；在PO-EVLPs治疗小鼠中注射miR159-y antagomir，观察对PO-EVLPs保护作用的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 葡聚糖硫酸钠 | Yeasen | 60316ES76 |
| 氧化偶氮甲烷 | Sigma-Aldrich | A5486 | |
| 肠道通透性检测 | FITC-葡聚糖（分子量4000） | MCE | HY-128868A |
| Western blot | 山羊抗兔IgG（H+L）辣根过氧化物酶标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | 31460 |
| ECL超敏化学发光底物试剂盒 | ABclonal | RM02867 | |
| 溶菌酶抗体 | ABclonal | A10972 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | ABclonal | A20798 | |
| 波形蛋白抗体 | ABclonal | A19607 | |
| N-钙黏蛋白抗体 | ABclonal | A19083 | |
| TGF-β受体II抗体 | ABclonal | A1415 | |
| 黏蛋白2抗体 | ABclonal | A4767 | |
| 磷酸化Smad3抗体 | ABclonal | AP0727 | |
| Smad3抗体 | Proteintech | 66516-1-Ig | |
| 免疫荧光 | CoraLite® Plus 488标记山羊抗兔重组二抗（H+L） | Proteintech | RGAR002 |
| CoraLite® Plus 594标记山羊抗小鼠重组二抗（H+L） | Proteintech | RGAM004 | |
| Western blot | Smad4抗体 | Proteintech | 83169-5-RR |
| 闭锁小带蛋白1抗体 | Proteintech | 82870-7-RR | |
| 闭合蛋白抗体 | Selleck | F22C23 | |
| ILC分离 | Percoll密度梯度介质 | GE Healthcare | -- |
| VIII型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| ILC分选 | EasySep™小鼠泛ILC富集试剂盒 | Stemcell | 19875 |
| 细胞培养 | 白细胞介素-23 | Gibco | -- |
| 白细胞介素-1β | Gibco | -- | |
| mIHC | 酪胺信号放大染料 | Servicebio | G1257-50T |
| HE染色 | 中性树胶封片剂 | Servicebio | G1003 |
| IHC | Ki67抗体 | Servicebio | GB151499-100 |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 |
| 抗CD16/32抗体 | eBioscience | 93 | |
| CD127抗体 | eBioscience | A7R34 | |
| CD45抗体 | eBioscience | 30-F11 | |
| NKp46抗体 | eBioscience | 29A1.4 | |
| CD3e抗体 | eBioscience | 145-2C11 | |
| CD8a抗体 | eBioscience | 53-6.7 | |
| CD19抗体 | eBioscience | 1D3 | |
| CD11b抗体 | eBioscience | M1/70 | |
| CD11c抗体 | eBioscience | N418 | |
| F4/80抗体 | eBioscience | BM8 | |
| TER-119抗体 | eBioscience | TER-119 | |
| Ly-6G抗体 | eBioscience | 1A8 | |
| Ly-6C抗体 | eBioscience | HK1.4 | |
| 芳香烃受体抗体 | eBioscience | 4MEJJ | |
| 细胞刺激混合物（含蛋白转运抑制剂，500×） | eBioscience | 00-4975 | |
| 细胞内固定和透化试剂盒 | eBioscience | 88-8824-00 | |
| 血清生化分析 | 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | njjcbio | C009-2-1 |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | njjcbio | C010-2-1 | |
| 血清肌酐检测试剂盒 | njjcbio | C011-2-1 | |
| 血尿素氮检测试剂盒 | njjcbio | C013-2-1 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778100 |
| Lipofectamine™ 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| Opti-MEM减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 细胞摄取示踪 | PKH26荧光染料 | Umibio | UR52302 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| UC和慢性结肠炎模型构建及给药 | DSS浓度与周期、PO-EVLPs灌胃剂量（30和60 mg/kg）、给药频次（每日）、每组样本量（n=6） 阅读提示：Methods 2.2 Mouse model；Figure 2A图注 |
| CAC模型构建及给药 | AOM腹腔注射剂量（10 mg/kg）、DSS浓度（2%）与周期、PO-EVLPs灌胃剂量、实验总时长（70天）、生存监测样本量（n=10） 阅读提示：Methods 2.2 Mouse model；Figure 3A图注 |
| PO-EVLPs体内生物分布 | Cy7-PO-EVLPs灌胃剂量（30 mg/kg）、成像时间点（1、6、12、24 h）、DSS预处理方案 阅读提示：Methods 2.6 In vivo distribution of PO-EVLPs；Figure 4 |
| 结肠ILC分离与培养 | 胶原酶VIII和DNase I浓度（150 μg/mL）、消化时间（90 min）、Percoll密度梯度（40%和80%）、ILC培养基添加因子及浓度 阅读提示：Methods 2.9 ILC isolation；2.10 Intestinal lymphocyte sorting |
| ILC体外TGF-β和PO-EVLPs处理 | TGF-β浓度（文中未明确说明）、PO-EVLPs浓度（文中未明确说明）、处理时间（72 h）、流式检测指标 阅读提示：Figure 6G–I图注；Results 3.6 |
| miR159-y靶向TGFBR2验证 | TGFBR2 3′UTR野生型/突变型质粒构建、miR159-y mimic浓度（文中未明确说明）、共转染细胞（HEK-293T）、检测时间（48 h） 阅读提示：Methods 2.19 Dual-luciferase reporter assay；Figure 8D和E |
| miR159-y agomir体内治疗 | 给药剂量（500 pmol或1 nmol）、给药途径（腹腔注射）、给药频次和疗程（文中未明确说明）、每组样本量（n=6） 阅读提示：Results 3.8；Figure 8G–M图注 |
| PO-EVLPs组分活性筛选 | 组分提取方法、等效质量策略（35 mg PO-EVLPs对应17.5 mg/mL）、处理时间（24 h）、检测指标（TGFBR2蛋白表达） 阅读提示：Methods 2.20 Extraction of PO-EVLP components；Figure 8A |