筛选与鉴定潜在益生菌
鉴定DSS结肠炎小鼠中可能具有抗炎作用的肠道菌群变化。
对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠和正常小鼠的粪便进行16S rRNA测序，比较物种水平丰度差异，并通过qPCR验证约氏乳杆菌在慢性及急性结肠炎中的定植变化。
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约氏乳杆菌通过TLR1/2-STAT3介导的CD206+巨噬细胞IL-10激活减轻结肠炎
Lactobacillus johnsonii alleviates colitis by TLR1/2-STAT3 mediated CD206+ macrophagesIL-10 activation
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型（DSS急慢性结肠炎、巨噬细胞清除、STAT3抑制、TLR1/2抑制、Il10-/-小鼠）及临床样本分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
DSS诱导的慢性结肠炎小鼠模型 DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） Raw264.7小鼠巨噬细胞系 UC患者结肠组织样本
重点核对
小鼠品系：C57BL/6（6-8周龄）和Il10-/-小鼠 DSS浓度和暴露时间：慢性为2% DSS 5天+14天水循环3次；急性为3% DSS 7天 L. johnsonii灌胃剂量：1×10^9 CFU/200μl/天 抑制剂处理：Stattic（体内4mg/kg，体外10μM）和CPT22（体内3mg/kg，体外10μM） 巨噬细胞清除模型：腹腔注射1mg Clophosome-A（CloA）
摘要
肠道微生物群稳态失衡与溃疡性结肠炎（UC）的发生有关，益生菌被认为可以调节免疫微环境和修复屏障功能。为了揭示UC与肠道微生物群之间的相互作用，我们通过16S rRNA测序从葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠中筛选出一种新的益生菌株，并探讨了其机制和临床相关性。约氏乳杆菌（L. johnsonii）作为一种潜在的抗炎细菌，在结肠炎小鼠中定植减少。灌胃约氏乳杆菌可通过特异性增加肠道巨噬细胞的比例和IL-10的分泌来减轻结肠炎，这在巨噬细胞清除模型和Il10−/−小鼠中得到证实。我们将在约氏乳杆菌作用下被激活的免疫细胞亚群鉴定为CD206+巨噬细胞IL-10。机制上，补充约氏乳杆菌通过STAT3的激活增强了CD206+巨噬细胞IL-10的动员，这在体内和体外均得到验证。此外，我们揭示了TLR1/2对于STAT3的激活以及巨噬细胞对约氏乳杆菌的识别至关重要。临床上，UC组织中约氏乳杆菌的丰度与MRC1、IL10和TLR1/2的表达水平呈正相关。约氏乳杆菌可通过TLR1/2-STAT3通路将天然巨噬细胞激活为CD206+巨噬细胞并释放IL-10，从而缓解实验性结肠炎。约氏乳杆菌可能作为UC的免疫调节剂和抗炎治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 约氏乳杆菌是否通过调节巨噬细胞介导的抗炎机制来缓解溃疡性结肠炎？
- 核心机制
- 约氏乳杆菌通过TLR1/2识别激活STAT3信号通路，促进CD206+巨噬细胞活化并分泌IL-10，从而缓解实验性结肠炎。
- 主要证据
- 在DSS急慢性结肠炎模型中灌胃约氏乳杆菌可减轻炎症并增加肠道CD206+巨噬细胞比例；巨噬细胞清除或Il10-/-小鼠中抗炎效果消失；体外BMDMs和Raw264.7细胞中约氏乳杆菌诱导CD206表达和IL-10分泌，且依赖STAT3和TLR1/2；临床样本中约氏乳杆菌丰度与MRC1、IL10、TLR1/2正相关。
- 研究意义
- 约氏乳杆菌可能作为UC的免疫调节剂和抗炎治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估约氏乳杆菌对结肠炎的治疗效果
验证约氏乳杆菌灌胃能否减轻DSS诱导的结肠炎并保护肠道屏障。
构建DSS慢性结肠炎模型，分别灌胃PBS、E. coli MG1655或约氏乳杆菌，检测腹泻评分、结肠长度、炎症评分、HE染色、阿尔辛蓝-PAS染色、Muc2和ZO-1免疫组化，以及炎症因子表达。
证明巨噬细胞在约氏乳杆菌抗炎中的作用
确定巨噬细胞是否是约氏乳杆菌发挥抗炎作用所必需的免疫细胞。
通过流式细胞术分析结肠固有层免疫细胞组成，并用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞，观察约氏乳杆菌的抗炎效果是否消失。
验证约氏乳杆菌促进CD206+巨噬细胞IL-10的激活
验证约氏乳杆菌是否特异性地诱导CD206+巨噬细胞并促进其分泌IL-10。
在体内和体外检测CD206+巨噬细胞比例和IL-10表达，通过RNA测序分析约氏乳杆菌处理的BMDMs中基因表达变化，并在Il10-/-小鼠中验证IL-10的必要性。
探究STAT3信号通路的作用
确定STAT3信号是否是约氏乳杆菌激活CD206+巨噬细胞IL-10所必需的。
通过KEGG富集分析发现JAK-STAT通路富集，用Western blot检测STAT3磷酸化水平，并用STAT3抑制剂Stattic在体内外抑制STAT3，观察对CD206和IL-10表达及抗炎效果的影响。
验证TLR1/2在识别约氏乳杆菌中的作用
确定TLR1/2是否是巨噬细胞识别约氏乳杆菌并激活下游信号所必需的。
通过RT-qPCR和Western blot检测TLR1/2表达，用TLR1/2抑制剂CPT22在体内外阻断TLR1/2，观察对STAT3磷酸化、CD206+巨噬细胞活化及IL-10分泌的影响。
临床样本相关性分析
评估约氏乳杆菌丰度与UC患者相关基因表达的相关性。
收集UC患者（n=13）和正常对照（n=22）结肠组织，通过RT-qPCR检测约氏乳杆菌丰度及MRC1、IL10、TLR1/TLR2表达，并进行Spearman相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 粪便DNA提取 | 天根粪便DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP328-02 |
| 组织DNA提取 | 天根DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304-02 |
| RT-qPCR | qPCR SYBR Green预混液 | YEASON | 11198ES08 |
| 细菌培养 | MRS培养基 | hopebio | HB0384-5 |
| LB培养基 | Sangon Biotech | A507002 | |
| 动物造模 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 160110 |
| 信号通路抑制 | Stattic | Selleckchem | S7024 |
| CPT22 | Selleckchem | S8677 | |
| 组织消化 | D-Hank's缓冲液 | Meilunbio | MA0039 |
| 二硫苏糖醇 | Meilunbio | MB3047-1 | |
| Hank's缓冲液 | Meilunbio | MA0041 | |
| IV型胶原酶 | Sangon | A005318 | |
| 流式细胞术 | CD16/32抗体 | Biolegend | 101320 |
| 可固定活力染料510 | BD Biosciences | 564406 | |
| Alexa Fluor 700-CD45抗体 | BD Biosciences | 560510 | |
| Brilliant Violet 605-CD11b抗体 | Biolegend | 101257 | |
| Brilliant Violet 421-F4/80抗体 | BD Biosciences | 565411 | |
| PE-I-A/I-E抗体 | BD Biosciences | 557000 | |
| APC-CD206抗体 | Biolegend | 141708 | |
| PE-CY7-CD11c抗体 | Biolegend | 117318 | |
| BUV395-Ly-6G抗体 | BD Biosciences | 563978 | |
| Brilliant Violet 711-NK1.1抗体 | Biolegend | 108745 | |
| Brilliant Violet 785-CD45R/B220抗体 | Biolegend | 103246 | |
| PECP-CY5.5-CD3抗体 | BD Biosciences | 551163 | |
| Brilliant Violet 605-CD4抗体 | Biolegend | 100548 | |
| APC-CY7-CD8抗体 | BD Biosciences | 561967 | |
| PE-CY7-Foxp3抗体 | BD Biosciences | 560408 | |
| Brilliant Violet 421-Gata3抗体 | BD Biosciences | 563349 | |
| Alexa Fluor 647-T-bet抗体 | BD Biosciences | 561267 | |
| PE-RORγt抗体 | R&D | IC6006P-025 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Genom | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | -- |
| PrimeScript™逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| RT-qPCR | SYBR Premix Ex Taq | Takara | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| 快速封闭液 | Beyotime | P0231 | |
| STAT3抗体 | CST | 4904 | |
| p-STAT3抗体 | CST | 9145 | |
| IL-10抗体 | ABclonal | A12255 | |
| TLR2抗体 | CST | 13744 | |
| ECL发光试剂盒 | Fdbio science | FD8000 | |
| 免疫组化 | 抗MUC2抗体 | Servicebio | GB14110 |
| 抗ZO-1抗体 | Servicebio | GB111402 | |
| 免疫荧光 | 抗F4/80抗体 | Servicebio | GB11027 |
| 抗IL-10抗体 | Servicebio | GB11108 | |
| 抗CD206抗体 | Servicebio | GB113497 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | 约氏乳杆菌在MRS培养基中，需10% H2、10% CO2、80% N2厌氧环境，37°C培养24小时；E. coli MG1655在LB培养基中，37°C培养。 阅读提示：参见Methods: Bacteria strain and culture |
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、DSS浓度和暴露周期、灌胃体积和菌量。 阅读提示：参见Methods: Animal models |
| 巨噬细胞清除模型 | Clophosome-A的给药剂量、时间点和途径。 阅读提示：参见Methods: Animal models (clodronate liposomes-mediated macrophage deletion model) |
| 信号通路抑制模型 | Stattic和CPT22的给药剂量、频率和途径（体内4mg/kg、3mg/kg隔天腹腔注射；体外10μM）。 阅读提示：参见Methods: Animal models (STAT3 inactivation model and TLR1/2 inhibition model) 和BMDMs and cell culture |
| 体外细胞实验 | BMDMs和Raw264.7细胞的培养条件、MOI=100:1、共培养时间24小时、抑制剂浓度。 阅读提示：参见Methods: Bone marrow derived macrophages (BMDMs) and cell culture |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、荧光染料、染色步骤、固定透化、细胞因子刺激条件（PMA/Ionomycin 2μl/ml，6小时）。 阅读提示：参见Methods: Flow cytometry analysis |
| 临床样本分析 | 样本来源、患者纳入标准、样本量（UC n=13, 正常 n=22）、RNA提取和qPCR方法。 阅读提示：参见Methods: Human sample collection 和DNA extraction and bacteria quantification |