建立基因诱导腹膜肿瘤模型（免疫缺陷鼠）
验证shp53、AKT和c-Myc组合能否在免疫缺陷鼠中诱导腹膜肿瘤形成。
向无胸腺裸鼠腹膜腔注射编码shp53、AKT、c-Myc、荧光素酶和SB转座酶的质粒，随后进行电穿孔（EP），通过IVIS成像监测肿瘤生长，并在EP后第21天处死小鼠，观察肿瘤形成及腹水情况，进行组织学分析。
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一种新型基因诱导小鼠模型，再现转移性腹膜癌病的组织学形态和免疫抑制性肿瘤微环境
Novel, genetically induced mouse model that recapitulates the histological morphology and immunosuppressive tumor microenvironment of metastatic peritoneal carcinomatosis
实验完整度
高包含免疫缺陷鼠和免疫活性鼠的体内模型建立、组织学与免疫组化表征、流式细胞术免疫分析、ELISA细胞因子检测、原代细胞系建立及其体内成瘤验证、抗体中和实验等多层级实验验证。
主要模型
C57BL/6免疫活性小鼠腹膜内基因诱导肿瘤模型 无胸腺裸鼠腹膜内基因诱导肿瘤模型 NSG小鼠p53突变体腹膜内基因诱导肿瘤模型 PACS-1原代培养肿瘤细胞系及其异种移植模型
重点核对
质粒组合：shp53 + AKT + c-Myc + SB转座酶（各10 μg/质粒） 电穿孔参数：BTX ECM 830，5个脉冲，200V，100ms/脉冲，间隔100ms 小鼠品系及周龄：6周龄雌性C57BL/6、无胸腺裸鼠、NSG小鼠 肿瘤生长监测：IVIS生物发光成像，每周一次 抗TGFβ、抗PD-1、抗PD-L1抗体给药方案：IP注射，剂量分别为5 mg/kg、10 mg/kg、10 mg/kg，于EP后第7、9、11、14、16天
摘要
背景
腹膜癌病是晚期腹膜肿瘤进展的标志，尤其是输卵管/卵巢高级别浆液性癌（HGSC）。腹膜癌病患者生存率低，且由于肿瘤在腹膜腔广泛播散而难以临床治疗。
方法
我们开发了一种临床相关的、基因诱导的腹膜癌病模型，通过向免疫活性小鼠腹膜腔内注射shp53、AKT、c-Myc、荧光素酶和sleeping beauty转座酶，随后进行电穿孔（EP），再现转移性腹膜HGSC的组织学形态和肿瘤微环境的免疫抑制状态。
结果
与人类卵巢癌的播散相似，IP/EP小鼠表现出多个附着于腹膜的肿瘤结节。组织病理学分析表明这些肿瘤为上皮来源。这些IP/EP小鼠还表现出肿瘤中CD3+T细胞浸润缺失，肿瘤浸润及全身CD4+和CD8+T细胞中抑制性检查点分子高表达，以及腹水中转化生长因子-β水平升高，这些均促进肿瘤生长。
结论
总之，我们的肿瘤模型再现了临床腹膜HGSC转移，使其成为临床前药物筛选、基于免疫治疗的疗法测试以及腹膜癌病肿瘤生物学研究的理想模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在建立一种临床相关、基因诱导的腹膜癌病小鼠模型，以模拟人类转移性腹膜高级别浆液性癌（HGSC）的组织学形态和免疫抑制性肿瘤微环境，并验证其用于临床前药物筛选和免疫治疗测试的可行性。
- 核心机制
- shp53、AKT和c-Myc的协同表达通过抑制p53功能、激活AKT和c-Myc通路，驱动腹膜上皮细胞转化，并诱导免疫抑制性肿瘤微环境，包括CD3+T细胞浸润减少、抑制性检查点分子（PD-1、TIM-3、TIGIT）在肿瘤浸润CD4+和CD8+T细胞上表达上调、Tregs富集以及腹水中TGFβ水平升高，从而促进肿瘤生长。
- 主要证据
- 免疫缺陷和免疫活性小鼠中，携带三个基因改变的IP/EP小鼠在EP后约3周内形成多发腹膜肿瘤结节并伴有血性腹水，组织学呈现HGSC典型特征（乳头状结构、细胞异型性、高Ki67指数），并表达上皮标志物CK14；免疫分析显示肿瘤中CD3+T细胞缺失，TILs中PD-1、TIM-3、TIGIT表达升高，Tregs比例约40%，腹水TGFβ水平显著升高；原代培养的PACS-1细胞系在B6小鼠中具有成瘤性，并表达CA125、mesothelin、FOLR1、WT1和PAX8等HGSC相关标志物。
- 研究意义
- 该模型再现了临床腹膜HGSC的转移过程，为临床前药物筛选、基于免疫治疗的疗法测试以及腹膜癌病肿瘤生物学研究提供了理想平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立基因诱导腹膜肿瘤模型（免疫活性鼠）并确定最小基因需求
在免疫活性C57BL/6小鼠中确定诱导腹膜肿瘤所需的最小基因组合，并比较三基因组合与双基因组合的肿瘤形成能力。
将不同质粒组合（shp53+AKT+c-Myc+SB13，或shp53+AKT+SB13，shp53+c-Myc+SB13，AKT+c-Myc+SB13）IP注入B6小鼠后EP，每周IVIS成像监测生物发光，绘制Kaplan-Meier生存曲线，并在处死后观察肿瘤播散部位。
肿瘤组织学与免疫组化表征
评估肿瘤的组织学形态和免疫表型，确认其是否符合HGSC特征。
对三基因IP/EP小鼠的肿瘤组织进行H&E、Ki67、CK14、p53、c-Myc和AKT的免疫组化染色，由病理学家审查。
评估免疫抑制性肿瘤微环境
明确肿瘤模型中免疫抑制微环境的特点，包括T细胞浸润、抑制性检查点分子表达、Tregs比例及细胞因子水平。
通过免疫荧光检测肿瘤CD3+T细胞；通过流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞和脾脏淋巴细胞的抑制性检查点分子（PD-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4）表达及Tregs比例；通过ELISA检测腹水或腹膜洗涤液中TGFβ、IL-10和IL-35水平。
抗体中和实验验证免疫抑制机制
评估中和TGFβ、PD-1或PD-L1对肿瘤生长的影响，以验证这些分子在肿瘤进展中的作用。
对三基因IP/EP小鼠分别腹腔注射抗TGFβ、抗PD-1或抗PD-L1中和抗体，定时监测肿瘤生长。
建立原代肿瘤细胞系PACS-1并验证其成瘤性
从IP/EP小鼠肿瘤中建立原代细胞系，并验证其在免疫活性小鼠中的致瘤能力及肿瘤标志物表达。
从IP/EP小鼠中取出肿瘤结节，进行酶消化和培养，建立PACS-1细胞系；将PACS-1细胞腹腔或皮下注射到B6小鼠中，监测肿瘤形成；通过qRT-PCR检测肿瘤标志物表达。
p53突变体组合的肿瘤诱导实验
测试p53功能性突变体（R175H/R172H）与AKT、c-Myc组合能否在免疫缺陷或免疫活性鼠中诱导腹膜肿瘤，以模拟临床p53突变癌症。
将人类或小鼠p53突变体质粒（p53R175H或p53R172H）与AKT、c-Myc和SB13一起IP注入NSG或B6小鼠，随后EP，监测肿瘤形成和生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | BTX ECM 830方波电穿孔仪 | BTX | -- |
| IVIS Series 2000成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| D-荧光素 | GoldBio | -- | |
| 组织学分析 | Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | 12202 |
| 免疫组织化学 | 抗小鼠CK14抗体 | Proteintech | 10143-1-AP |
| p53抗体 | Proteintech | 21891-1-AP | |
| AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| c-Myc抗体 | Abcam | ab32073 | |
| 多聚HRP山羊抗兔IgG二抗 | Invitrogen | 65-6120 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100201 |
| SYTOX Green核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | 尼康TE200E倒置显微镜 | Nikon | -- |
| RNA提取 | Direct-zol RNA提取试剂盒 | Zymo Research | -- |
| 逆转录 | iScript逆转录预混液 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| qRT-PCR | SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 流式细胞术 | 红细胞裂解液 | Biolegend | -- |
| Zombie Aqua染料 | Biolegend | -- | |
| PE标记抗小鼠CD4抗体 | BD | 553049 | |
| APC-R700标记抗小鼠CD8抗体 | BD | 564983 | |
| 抗小鼠CD16/CD32抗体 | Bio X Cell | BE0307 | |
| eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞培养 | 干扰素-γ | Prospec-Tany Technogene | -- |
| 流式细胞术 | 抗小鼠PD-L1抗体 | Biolegend | 124311 |
| ELISA | LEGEND MAX总TGF-β1 ELISA试剂盒 | Biolegend | -- |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| LEGEND MAX小鼠IL-35异二聚体ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| 原代细胞培养 | 胶原酶I | Sigma-Aldrich | C9891 |
| 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | DN25-g | |
| gentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗体中和实验 | 抗小鼠TGFβ中和抗体 | -- | -- |
| 抗PD-1抗体 | -- | -- | |
| 抗PD-L1抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物与质粒注射 | 动物品系、周龄、性别；质粒组合；质粒浓度；注射体积 阅读提示：查看Methods中'Mice'和'EP tumor model'部分 |
| 电穿孔参数 | 电穿孔仪型号、电压、脉冲次数、脉冲持续时间、间隔时间 阅读提示：查看Methods中'EP tumor model'部分 |
| 肿瘤监测与终点 | IVIS成像频率；处死标准（生物发光信号阈值或腹水情况） 阅读提示：查看Methods中'EP tumor model'和'In vivo bioluminescence image'部分 |
| 免疫表型分析 | 肿瘤、脾脏和腹水取样时间；抗体克隆及荧光标记；FMO对照 阅读提示：查看Methods中'Flow cytometry'部分和Figure 4图注 |
| 细胞因子检测 | 腹水或腹膜洗涤液收集方法；ELISA试剂盒及检测细胞因子 阅读提示：查看Methods中'ELISA'部分 |
| 原代细胞培养及成瘤实验 | 肿瘤消化酶及浓度；细胞培养基成分；注射细胞数量、体积和途径 阅读提示：查看Methods中'Generation of primary cultures tumor cell line'部分和Figure 5图注 |