发现队列单细胞转录组分析
识别与PD-1阻断响应相关的肿瘤和免疫细胞群体
对6例RS和2例CLL患者的纵向骨髓样本进行FACS分选，分离恶性（CD5+CD19+）和非恶性（CD5−CD19−）细胞，进行scRNA-seq，联合聚类分析。
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ZNF683标记的CD8+ T细胞群体与里氏综合征抗PD-1治疗后的抗肿瘤免疫相关
ZNF683 marks a CD8+ T cell population associated with anti-tumor immunity following anti-PD-1 therapy for Richter syndrome.
实验完整度
高包含患者样本单细胞转录组、TCR分析、体外细胞系过表达、CUT&RUN及外部数据集验证
主要模型
里氏综合征患者骨髓样本 Jurkat细胞系（ZNF683过表达） 实体瘤患者外周血T细胞
重点核对
发现队列：6例RS患者（4例响应，2例非响应）和2例CLL患者的纵向骨髓样本 验证队列：7例独立RS患者治疗前外周血T细胞RNA-seq及3例额外RS患者 Jurkat细胞系中多西环素诱导ZNF683-FLAG过表达，48小时处理后进行RNA-seq和CUT&RUN CUT&RUN使用抗FLAG抗体、H3K4me3和IgG对照，峰分析FDR<0.1 单细胞RNA-seq数据联合聚类使用Conos v1.3.1，差异表达分析使用DESeq2
摘要
与许多其他血液系统恶性肿瘤不同，里氏综合征（RS）是一种起源于惰性慢性淋巴细胞白血病的侵袭性B细胞淋巴瘤，对PD-1阻断有响应。为了发现响应的决定因素，我们分析了从6名RS患者纵向收集的17份骨髓样本生成的单细胞转录组数据。响应与中间耗竭的CD8效应/效应记忆T细胞相关，这些细胞以转录因子ZNF683高表达为标志，被确定从干细胞样记忆细胞演化而来，并与终末耗竭细胞不同。该特征与抗PD-1响应的实体瘤中的肿瘤浸润群体特征重叠。发现ZNF683直接靶向关键T细胞基因（TCF7、LMO2、CD69）并影响T细胞细胞毒性和激活通路。对10名独立RS患者抗PD-1治疗前的 peripheral blood 以及抗PD-1治疗的实体瘤患者的分析支持ZNF683high T细胞与响应的关联。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 里氏综合征对PD-1阻断响应的免疫决定因素是什么？
- 核心机制
- ZNF683标记一群中间耗竭的CD8+效应/效应记忆T细胞，该群体从干细胞样记忆细胞演化而来，与终末耗竭细胞不同；ZNF683直接结合并调控TCF7、LMO2、CD69等关键T细胞基因，影响T细胞细胞毒性和激活通路。
- 主要证据
- 对RS患者骨髓的单细胞RNA-seq和TCR分析显示响应者中ZNF683high CD8+ T细胞富集；体外Jurkat细胞过表达ZNF683结合RNA-seq和CUT&RUN揭示其直接靶基因和通路；外周血和实体瘤数据集分析支持ZNF683high特征与响应相关。
- 研究意义
- 提示ZNF683高表达T细胞特征可能作为跨多种恶性肿瘤预测PD-1阻断响应的生物标志物，并为了解T细胞耗竭分化提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞亚群鉴定与表型分析
表征骨髓浸润T/NK细胞亚群，鉴定与响应相关的T细胞状态
对非肿瘤细胞中的T/NK细胞进行亚聚类，鉴定11个转录簇，通过标记基因和CITE-seq表面蛋白定义簇身份，比较响应者与非响应者的簇比例和基因表达。
TCR repertoire和轨迹分析
评估T细胞克隆动态和分化路径
对代表性响应者（RS-R2）和非响应者（RS-NR1）进行单细胞TCR测序，对3例响应者和4例非响应者进行bulk TCR测序，使用slingshot进行轨迹分析。
ZNF683功能验证
验证ZNF683对T细胞基因和通路的直接调控作用
在Jurkat细胞中建立多西环素诱导的ZNF683-FLAG过表达，进行RNA-seq和CUT&RUN，结合CISTROME-GO和MEME-ChIP分析靶基因和结合基序。
外周血和实体瘤验证
在独立患者外周血和实体瘤数据中验证ZNF683high特征与响应的关联
对7例独立RS患者治疗前外周血T细胞进行bulk RNA-seq，对3例额外RS患者进行验证，并与已发表的黑色素瘤和肺癌数据集比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组与免疫组库分析
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术分选 | 抗CD19抗体（PE-Cy7） | Biolegend | 302216 |
| 抗CD5抗体（BV421） | Biolegend | 300626 | |
| 抗CD3抗体（Pacific Blue） | Biolegend | 300330 | |
| 7-AAD活力染色液 | Biolegend | 420404 | |
| CITE-seq | Zombie Violet可固定活力试剂盒 | Biolegend | 423114 |
| 抗CD235抗体 | BD Biosciences | 555570 | |
| 单细胞RNA-seq | Chromium Next GEM单细胞5'试剂盒v2 | 10x genomics | 1000244 |
| Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v2 | 10x genomics | PN-120237 | |
| bulk RNA-seq | CD3磁珠 | Miltenyi Biotec | 130–050-101 |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| Qiagen RNeasy微量试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| RNA-seq文库构建 | NEBNext单细胞/低输入文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | E6420L |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录预混液 | Takara Bio | RR036A |
| TaqMan基因表达预混液 | Life Technologies | 4369514 | |
| ZNF683 Taqman探针 | Life Technologies | Hs00543184_m1 | |
| 细胞培养 | 多西环素 | Takara Bio | 631311 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Life Technologies | A1113803 |
| Western blot | Pierce™ NE-PER®核质分离试剂盒 | Thermo Scientific | 78833 |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S | |
| DYKDDDDK标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2368S | |
| HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 34580 | |
| CUT&RUN | CUTANA™ ChIC/CUT&RUN试剂盒（H3K4Me3、IgG对照） | EpiCypher | 14–1048 |
| 抗FLAG抗体 | Fisher | FG4R | |
| NEBNext® Ultra™ II DNA文库构建试剂盒（Illumina®） | NEB | E7645S/L | |
| NEBNext多重寡核苷酸（Illumina双索引引物） | NEB | E7600 | |
| CUT&RUN测序 | MiniSeq高通量试剂盒（150循环） | Illumina | FC-420–1002 |
| RNA-seq文库定量 | 高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | 5067–4626 |
| RNA-seq | TruSeq链特异性总RNA LT样本制备试剂盒（含Ribo-Zero Gold） | Illumina | 20020598 |
| DNA纯化 | Wizard SV凝胶和PCR纯化系统 | Promega | A9282 |
| RNA定量 | Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒 | Thermo Scientific | R11490 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 发现队列样本采集与处理 | 样本来源：6例RS（4例响应，2例非响应）和2例CLL患者；采样时间点：基线、治疗中、响应评估；样本类型：骨髓 阅读提示：Methods 'Human samples'及Figure 1A、Table S1 |
| 单细胞RNA-seq分选策略 | 分选群体：CD5+CD19+恶性细胞和CD5−CD19−非恶性细胞；RS与CLL细胞按大小（FSC/SSC）分离 阅读提示：Methods 'Flow cytometry sorting for single-cell analysis'及Figure 1B |
| Jurkat细胞系ZNF683过表达 | 多西环素浓度：1 μg/mL；处理时间：48小时；细胞系：Jurkat E6-1；转染质粒：pSB-tet-GP-ZNF683-flag 阅读提示：Methods 'Generation of ZNF683-expressing Jurkat cell lines' |
| CUT&RUN实验 | 抗体：抗FLAG、H3K4me3、IgG对照；交联条件：0.1%甲醛1分钟；透化：0.001% Digitonin；重复数：有/无ZNF683表达各n=2 阅读提示：Methods 'CUT&RUN' |
| 外周血验证队列 | 样本：7例独立RS患者治疗前外周血T细胞（2例响应，5例非响应），另3例额外验证；T细胞分离：CD3 MicroBeads 阅读提示：Results 'ZNF683 expression in peripheral blood is associated with response to immune checkpoint blockade'及Figure 7A-B |