评估AZD7648对HDR效率的影响
验证AZD7648是否提高多个内源位点的HDR效率
在K-562、RPE-1 p53+/+和p53−/−、HSPCs及上气道类器官中，电转Cas9–sgRNA RNP并共递送ssODN，电转后立即用1 μM AZD7648处理3天，通过短读长测序（Illumina）检测HDR和indel频率。
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使用增强HDR的DNA-PKcs抑制剂AZD7648进行基因组编辑会导致大规模基因组改变
Genome editing with the HDR-enhancing DNA-PKcs inhibitor AZD7648 causes large-scale genomic alterations.
实验完整度
高研究在多种细胞系、原代细胞和类器官中，结合短读长/长读长测序、ddPCR、scRNA-seq和CAST-seq，系统验证了AZD7648诱导的大规模基因组改变，包含功能验证和机制探索。
主要模型
K-562细胞系（含FIRE报告基因和eGFP单拷贝克隆） RPE-1 p53+/+和p53−/−细胞系 人CD34+造血干/祖细胞（HSPCs） 人上气道类器官
重点核对
AZD7648处理浓度1 μM，处理时间3天（电转后立即开始） 长读长测序（ONT）检测千碱基级缺失的频率和大小 ddPCR定量eGFP和KMT2C拷贝数变化 scRNA-seq分析约40,000个单细胞中靶位点附近基因表达丢失 CAST-seq无偏检测染色体易位
摘要
DNA-PKcs抑制剂AZD7648可提高CRISPR–Cas9介导的同源定向修复效率，具有临床应用的潜力，但其可能的在靶后果尚不清楚。我们发现，使用AZD7648进行基因组编辑会导致频繁的千碱基级和兆碱基级缺失、染色体臂丢失和易位。这些大规模染色体改变逃避了典型基因组编辑检测的检测，提示在应用AZD7648时应谨慎，并强调需要研究多种类型的潜在编辑结果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 使用DNA-PKcs抑制剂AZD7648增强HDR的基因组编辑是否会产生未预期的在靶基因组后果？
- 核心机制
- AZD7648抑制DNA-PKcs增强HDR，但同时导致Cas9诱导的在靶基因组不稳定，将小规模NHEJ结果转化为短读长测序无法检测的大规模缺失、染色体臂丢失和易位。
- 主要证据
- 在K-562、RPE-1 p53+/+和p53−/−、人CD34+ HSPCs及上气道类器官中，结合短读长/长读长测序、ddPCR、scRNA-seq和CAST-seq，发现AZD7648增加千碱基至兆碱基级缺失、染色体臂丢失和易位。
- 研究意义
- 提示在基因组编辑中应用AZD7648需谨慎，并强调需要研究短读长靶向扩增子NGS可检测范围之外的遗传结果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
发现短读长测序与表型检测的差异
探究AZD7648处理下HDR表观升高是否由等位基因脱扣导致
使用FIRE报告基因系统，通过流式细胞术检测HDR（mScarlet+）和indel（eGFP+）事件，并与Sanger测序结果比较；进一步用长读长测序（ONT）分析FIRE位点3.5-kb窗口。
检测内源位点的千碱基级缺失
验证AZD7648是否在内源位点增加千碱基级缺失
在RPE-1 p53−/−、RPE-1 p53+/+、K-562和HSPCs中，针对多个内源位点进行长读长测序（PCR扩增子3.8–5.9 kb），量化大于1 kb的缺失频率和大小。
检测兆碱基级缺失和染色体臂丢失
探究AZD7648是否导致超出长读长测序检测范围的兆碱基级基因组改变
使用K-562 eGFP单拷贝克隆细胞系，在eGFP插入位点−1.3 Mb（SMURF1）或+1.0 Mb（IFT22）处编辑，通过流式细胞术检测eGFP丢失，ddPCR定量eGFP和KMT2C拷贝数；在另一些实验中，编辑上气道类器官和HSPCs的GAPDH 3′ UTR，进行scRNA-seq分析基因表达丢失。
检测染色体易位
验证AZD7648是否增加单sgRNA编辑时的染色体易位频率
在CD34+ HSPCs、RPE-1 p53−/−和p53+/+细胞中，针对三个不同位点（HBB、CCR5等）进行编辑，使用CAST-seq无偏检测易位。
测试PolQi2对AZD7648诱导的大规模缺失的影响
探究抑制MMEJ能否减少AZD7648诱导的大规模缺失
在RPE-1 p53−/−、RPE-1 p53+/+和K-562 eGFP细胞中，联合使用AZD7648（1 μM）和PolQi2（3 μM）处理3天，通过短读长和长读长测序检测HDR和缺失频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco | 11875093 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| StemSpan SFEM II培养基 | STEMCELL Technologies | 09655 | |
| StemSpan CC110 | STEMCELL Technologies | 02697 | |
| FLT3配体 | Miltenyi Biotec | 130-096-474 | |
| 血小板生成素 | Miltenyi Biotec | 130-095-745 | |
| 干细胞因子 | Miltenyi Biotec | 130-096-491 | |
| SR1 | STEMCELL Technologies | 72342 | |
| UM729 | STEMCELL Technologies | 72332 | |
| 类器官培养 | 基底膜提取物 | -- | -- |
| 类器官传代 | Dispase II | Gibco | 17105041 |
| TrypLE | Gibco | 12604021 | |
| 类器官培养 | Y-27632 | TOCRIS | 1254 |
| 编辑试剂 | Alt-R S.p. Cas9核酸酶V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | -- |
| Alt-R CRISPR–Cas9 sgRNA | IDT | -- | |
| CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒 | Synthego | -- | |
| IVT | Phusion聚合酶 | New England Biolabs (NEB) | M0530L |
| HiScribe T7高产RNA合成试剂盒 | NEB | E2040L | |
| 虾碱性磷酸酶 | NEB | M0371S | |
| miRNeasy试剂盒 | Qiagen | 217084 | |
| DNA修复抑制 | AZD7648 | Selleck Chemicals | S8843 |
| PolQi2 | MedChemExpress | HY-150279 | |
| 电转 | 4D-Nucleofector X单元 | Lonza | AAF-1003X |
| gDNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| Maxwell RSC培养细胞DNA试剂盒 | Promega | AS1620 | |
| 扩增子测序 | NEBNext高保真2× PCR预混液 | NEB | M0541L |
| Quant-iT dsDNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q33120 | |
| 纳米孔测序 | PCR条形码扩展1–96试剂盒 | ONT | EXP-PBC096 |
| ddPCR | ddPCR探针预混液（无dUTP） | Bio-Rad | 186-3024 |
| HaeIII限制酶 | NEB | R0108S | |
| HindIII-HF限制酶 | NEB | R3104S | |
| rCutSmart缓冲液 | NEB | B6004S | |
| 剪切鲑鱼精DNA | Invitrogen | AM9680 | |
| 流式细胞术 | SYTOX Red死细胞染色剂 | Invitrogen | S34859 |
| CAST-seq | NEBNext Ultra II FS DNA文库制备试剂盒（用于Illumina） | NEB | E7805L |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AZD7648处理 | AZD7648浓度（1 μM）、处理时间（3天）、处理起始时间（电转后立即） 阅读提示：Methods中“Electroporation and DNA repair inhibition”小节及Figure 1图注 |
| 长读长测序（ONT） | PCR扩增子大小（3.8–5.9 kb）、测序平台（GridION或Mk1C）、数据过滤标准（Cutadapt三轮过滤） 阅读提示：Methods中“Nanopore sequencing”和“Long-read sequencing data analysis”小节 |
| ddPCR拷贝数定量 | gDNA用量（400–1,700 ng）、酶切条件（HindIII-HF 20 U，37°C 3小时）、退火温度（57°C） 阅读提示：Methods中“ddPCR”小节 |
| scRNA-seq | 细胞数（约40,000）、平台（10x Genomics Chromium）、分析软件（Seurat、inferCNV）及参数 阅读提示：Methods中“scRNA-seq”小节及Figure 2图注 |
| CAST-seq | gDNA输入量（200–220 ng）、技术重复数（2个）、测序深度、易位判定P值阈值（0.005） 阅读提示：Methods中“CAST-seq”小节 |