KARR-seq技术开发与验证
建立不依赖蛋白质-RNA交联的RNA-RNA互作检测方法，并验证其特异性与灵敏度。
在固定透化的mESCs中先用N3-乙氧醛标记RNA，再用DBCO修饰的树状分子进行点击化学交联，生物素富集交联产物， proximity ligation后测序；通过dot blot和凝胶电泳验证交联，与RIC-seq和PARIS数据比较。
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KARR-seq揭示细胞内高阶RNA结构与RNA-RNA相互作用
KARR-seq reveals cellular higher-order RNA structures and RNA-RNA interactions.
实验完整度
高包含多种细胞系体外实验、病毒感染的细胞模型、ASO功能验证、FISH成像验证，涉及多层级证据和功能验证。
主要模型
mESCs（小鼠胚胎干细胞） K562细胞（人慢性髓系白血病细胞） HepG2细胞（人肝癌细胞） A549细胞（人肺癌细胞）及RSV/VSV感染模型
重点核对
细胞系：mESCs、K562、HepG2、HEK293T、A549等 病毒：rgRSV（MOI 0.1，感染48小时）、rVSV-GFP（MOI 0.1，感染24小时） 翻译抑制剂：harringtonine（2 μg/ml，30分钟）或cycloheximide（100 μg/ml，30分钟） ASO处理：LNA ASO（80 nM，转染24小时后感染病毒） 交联剂：DBCO和生物素修饰的PAMAM树状分子（G1、G3、G5、G7）
摘要
RNA的命运和功能受其结构和相互作用组影响。然而，RNA和RNA结合蛋白（RBP）如何组装成高阶结构，以及RNA分子之间如何相互作用以促进功能，在很大程度上仍不清楚。在此，我们提出了KARR-seq，它利用N3-乙氧醛标记和多功能化学交联剂来共价捕获并测定细胞内的RNA-RNA相互作用和高阶RNA结构，不依赖于局部蛋白质与RNA的结合。KARR-seq能够以高灵敏度和准确性描绘高阶RNA结构并检测广泛的分子间RNA-RNA相互作用。利用KARR-seq，我们发现翻译在天然和应激条件下抑制mRNA的压缩。我们测定了呼吸道合胞病毒（RSV）和水疱性口炎病毒（VSV）的高阶RNA结构，并鉴定了病毒与宿主RNA之间可能调控病毒复制的RNA-RNA相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何不依赖蛋白质-RNA交联来检测细胞内高阶RNA结构和RNA-RNA相互作用，并探究其在翻译调控、应激响应和病毒感染中的作用？
- 核心机制
- KARR-seq利用N3-乙氧醛标记RNA和DBCO修饰的树状分子通过点击化学交联空间邻近的RNA，捕获高阶RNA结构和RNA-RNA相互作用；翻译通过核糖体移位解析mRNA分子内相互作用，抑制mRNA压缩；病毒RNA与宿主mRNA的相互作用可调控病毒复制。
- 主要证据
- 通过KARR-seq在多种细胞系中绘制RNA-RNA相互作用图谱，与RIC-seq和PARIS基准比较；翻译抑制剂处理和核糖体印迹数据分析；ASO阻断U3-ETS互作影响pre-rRNA水平；ASO阻断宿主mRNA与RSV RNA互作抑制RSV复制。
- 研究意义
- KARR-seq提供了一种不依赖蛋白质-RNA交联的RNA-RNA互作和RNA结构检测方法，揭示了翻译对mRNA高阶结构的抑制作用，并证明了病毒-宿主RNA互作的功能相关性，为研究RNA功能提供了新工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高阶RNA结构解析与验证
验证KARR-seq能否准确描绘高阶RNA结构，并与已知结构比较。
使用不同代数的树状分子（G1、G3、G5、G7）在mESCs和K562细胞中进行KARR-seq，将嵌合读段定位到TERC、U1、18S等具有冷冻电镜结构的RNA上，计算空间距离并比较。
翻译对mRNA高阶结构的影响
探究翻译是否影响mRNA的折叠和压缩程度。
在HepG2细胞中分别用harringtonine和cycloheximide处理抑制翻译，进行KARR-seq，计算折叠指数和beta系数；同时进行FISH成像测量mRNA 5′和3′端距离。
应激条件下RNA高阶结构重塑
研究亚砷酸盐诱导的氧化应激对mRNA高阶结构的影响。
用亚砷酸盐处理K562细胞诱导应激颗粒，进行KARR-seq，比较处理前后折叠指数变化，并分析应激颗粒定位转录本与非定位转录本的差异。
病毒-宿主RNA-RNA互作鉴定与功能验证
鉴定RSV和VSV的高阶RNA结构及其与宿主RNA的互作，并验证互作的功能相关性。
用rgRSV或rVSV-GFP感染A549细胞，进行KARR-seq，分析病毒RNA结构和病毒-宿主RNA互作；设计LNA ASO阻断特定互作，检测病毒复制水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995 |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875 | |
| RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 | |
| 病毒接种 | 重组人RSV A2株表达GFP | -- | -- |
| 重组VSV Indiana株表达GFP | -- | -- | |
| Western blot | 抗SRSF1抗体 | Bethyl Laboratories | A302–052A |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9717 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 | |
| 抗U1-70K抗体 | Abcam | ab83306 | |
| 抗YBX3抗体 | GeneTex | GTX130052 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Dot blot | Hybond-N+膜 | GE Healthcare | RPN119B |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Thermo Fisher Scientific | S-911 | |
| 树状分子合成 | PAMAM树状分子G1 | Sigma-Aldrich | 412384 |
| DBCO-NHS酯 | Sigma-Aldrich | 761524 | |
| 生物素-NHS酯 | Sigma-Aldrich | 203112 | |
| 乙酸酐 | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| KARR-seq | N3-乙氧醛 | -- | -- |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| SUPERNase抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65001 | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201L | |
| T4 RNA连接酶I | NEB | M0437M | |
| RNA清洁与浓缩试剂盒 | Zymo Research | R1014 | |
| SMARTer链特异性总RNA-seq试剂盒v2-Pico哺乳动物 | Takara | 634413 | |
| 细胞核分离 | NP40裂解液 | -- | -- |
| RNA FISH | Stellaris探针设计软件 | -- | -- |
| Cy3B NHS酯 | Cytiva | PA63101 | |
| P6微型生物旋转柱 | Bio-Rad | 7326228 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ASO阻断实验 | SF细胞系4D-Nucleofector X试剂盒 | Lonza | V4XC-2024 |
| TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| KARR-seq | N3-乙氧醛浓度（2 mM）、树状分子浓度（12.5 μM）、交联时间（37 °C 1小时）、甲醛固定浓度（1%） 阅读提示：Methods中KARR-seq小节 |
| 病毒感染的A549细胞KARR-seq | 病毒MOI（0.1）、感染时间（RSV 48小时，VSV 24小时）、细胞固定时间点 阅读提示：Methods中Virus inoculation小节 |
| 翻译抑制处理 | harringtonine浓度（2 μg/ml）和处理时间（30分钟）、cycloheximide浓度（100 μg/ml）和处理时间（30分钟） 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| 亚砷酸盐应激处理 | 亚砷酸钠浓度（200 μM）和处理时间（1小时） 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| ASO阻断病毒-宿主RNA互作 | ASO转染浓度（80 nM）、转染时间（24小时）、病毒感染MOI（0.1） 阅读提示：Methods中Analysis of RSV and VSV replication after ASO blockage小节 |