DVP工作流程开发与验证
建立结合AI图像分析、激光显微切割和超高灵敏度质谱的单细胞蛋白质组学流程，并验证其分割和切割准确性。
开发BIAS软件，整合深度学习细胞分割和机器学习表型分类；连接扫描和激光显微切割显微镜；使用nucleAIzer进行图像风格转移和分割；基准测试分割准确性；优化LMD切割参数。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
深度视觉蛋白质组学定义单细胞身份与异质性
Deep Visual Proteomics defines single-cell identity and heterogeneity.
实验完整度
高包含细胞培养、组织样本（输卵管、涎腺癌、黑色素瘤）多层级验证，并进行了功能与机制验证（蛋白质组、通路富集、IHC验证）。
主要模型
U2OS细胞系（含FUCCI和Lck-eGFP衍生株） 人输卵管上皮组织 涎腺腺泡细胞癌FFPE组织 原发性黑色素瘤FFPE组织
重点核对
U2OS细胞：80–100个单细胞或250–300个细胞核每表型，平均每个样品收集267个细胞核 FFPE组织：收集50–100个细胞每样品，面积80,000–160,000 µm² 激光显微切割：Leica LMD7，切割精度实际达到200 nm 质谱分析：diaPASEF或ddaPASEF模式，Thermo EASY-nLC-1200连接timsTOF Pro 数据分析：MaxQuant或DIA-NN，FDR 1%（蛋白质和肽段水平）
摘要
尽管已有基于成像和基于质谱的空间蛋白质组学方法，但将图像与单细胞分辨率蛋白质丰度测量相关联仍存在关键挑战。在此，我们介绍深度视觉蛋白质组学（DVP），它将人工智能驱动的细胞表型图像分析与自动化单细胞或单细胞核激光显微切割及超高灵敏度质谱相结合。DVP将蛋白质丰度与复杂的细胞或亚细胞表型联系起来，同时保留空间背景。通过从细胞培养物中逐个切除细胞核，我们根据已知和未表征的蛋白质所定义的蛋白质组谱对不同的细胞状态进行了分类。在一份存档的原发性黑色素瘤组织中，DVP鉴定了正常黑色素细胞向完全侵袭性黑色素瘤转变时的空间分辨蛋白质组变化，揭示了癌症进展过程中以空间方式变化的通路，例如转移性垂直生长中的mRNA剪接失调，同时伴有干扰素信号传导和抗原呈递的减少。DVP在组织背景下保留精确空间蛋白质组信息的能力对临床样本的分子分析具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何将图像信息与单细胞分辨率蛋白质丰度测量相关联，以在保留空间背景的同时分析细胞或亚细胞表型的蛋白质组？
- 核心机制
- DVP通过AI驱动的图像分析定义细胞或亚细胞表型，指导激光显微切割分离单个细胞或细胞核，并进行超高灵敏度质谱蛋白质组分析，从而将蛋白质丰度与复杂细胞表型及空间背景关联。
- 主要证据
- 在U2OS细胞中，DVP将细胞形态与蛋白质组谱关联，区分了五种间期细胞核类别，并鉴定了细胞周期相关蛋白如C7orf50；在黑色素瘤组织中，DVP揭示了从正常黑色素细胞到侵袭性黑色素瘤的空间蛋白质组变化，包括mRNA剪接上调与干扰素信号和抗原呈递下调。
- 研究意义
- DVP能够保留组织背景中的精确空间蛋白质组信息，对临床样本的分子分析具有重要意义，可发现癌症进展中空间方式变化的通路，并可能用于未来药物和诊断靶点的鉴定。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养模型中的单细胞异质性分析
验证DVP能否在未扰动癌细胞系中表征看似相似细胞之间的功能异质性，并将形态差异与蛋白质组差异关联。
使用FUCCI U2OS细胞，通过DNA染色和深度学习分割，分离整个细胞或细胞核；进行无监督机器学习分类细胞核形态；对每个类别进行蛋白质组分析；生物信息学分析差异蛋白和通路。
存档组织中的细胞类型特异性蛋白质组分析
验证DVP能否从存档FFPE组织中分离特定细胞类型并进行蛋白质组分析，以发现疾病相关蛋白特征。
使用涎腺腺泡细胞癌和正常涎腺组织，进行EpCAM免疫组化染色；BIAS分类正常和肿瘤细胞；激光显微切割分离细胞；质谱分析；比较正常与癌症蛋白质组；IHC验证候选蛋白。
黑色素瘤进展的空间蛋白质组分析
应用DVP解析原发性黑色素瘤进展不同阶段的空间蛋白质组变化，揭示与疾病进展相关的通路。
使用存档17年的原发性黑色素瘤FFPE组织，SOX10和CD146免疫组化双染；BIAS分类正常黑色素细胞、原位黑色素瘤、径向和垂直生长黑色素瘤等；激光显微切割分离不同区域细胞；质谱分析；生物信息学分析空间蛋白质组变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM（高糖，GlutaMAX） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | VWR | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| McCoy's 5A（改良）培养基GlutaMAX补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 36600021 | |
| 遗传霉素 | -- | -- | |
| Lck-GFP质粒 | Addgene | 61099 | |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 免疫组织化学染色 | 膜PEN载玻片1.0 | Zeiss | 415190-9041-000 |
| VECTABOND试剂 | Vector Labs | SP-1800-7 | |
| pH 9抗原修复液 | Dako | S2367 | |
| EpCAM抗体（克隆BS14） | Nordic BioSite | BSH-7402-1 | |
| SOX10抗体（克隆BS7） | Nordic BioSite | BSH-7959-1 | |
| CD146抗体（克隆EP54） | Cell Marque | AC-0052 | |
| EnVision FLEX，高pH检测试剂盒 | Dako | GV800 and GV809/GV821 | |
| EnVision DAB显色系统 | Dako | GV825 | |
| EnVision Magenta显色系统 | Dako | GV900 | |
| 免疫组织化学验证 | SRC/c-Src抗体（克隆36D10） | Cell Signaling Technology | 2109 |
| FASN抗体（克隆C20G5） | Cell Signaling Technology | 3180 | |
| CNN1抗体（克隆EP63） | Cell Marque | AC-0060 | |
| CK5抗体（克隆XM26） | Leica Biosystems | NCL-L-CK5 | |
| 免疫荧光染色 | EdU标记试剂盒 | Life Technologies | -- |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| GB封片剂 | GBI Labs | E01-18 | |
| 人纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| 山羊抗鸡Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21449 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 小鼠抗ANLN | Atlas Antibodies | amab90662 | |
| 小鼠抗CCNB1 | BD Biosciences | 610220 | |
| 兔抗C7orf50 | Atlas Antibodies | HPA052281 | |
| FOXJ1抗体 | Invitrogen | 14-9965-80 | |
| EpCAM抗体 | Cell Signaling Technology | 14452 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠 | Invitrogen | A21235 | |
| Alexa Fluor 555山羊抗兔 | Invitrogen | A21428 | |
| SYTO 10 | Invitrogen | 10624243 | |
| 高分辨率显微镜检查 | AxioImager Z.2显微镜 | Zeiss | -- |
| Colibri 7 LED光源 | Zeiss | -- | |
| AxioCam 702单色相机 | Zeiss | -- | |
| ZEN 2.6（蓝色版）软件 | Zeiss | -- | |
| 组织扫描 | Axio Scan.Z1玻片扫描仪 | Zeiss | -- |
| Hitachi HV-F202CLS相机 | Hitachi | -- | |
| 激光显微切割 | Leica LMD7系统 | Leica | -- |
| HC PL FLUOTAR L ×63/0.70 CORR XT物镜 | Leica | -- | |
| HC PL FLUOTAR L ×40/0.60 CORR XT物镜 | Leica | -- | |
| Leica激光显微切割V 8.2.3.7603软件 | Leica | -- | |
| 样品制备 | 384孔板 | Eppendorf | 0030129547 |
| 封板膜 | Corning | CLS6569-100EA | |
| 碳酸氢铵 | -- | -- | |
| 赖氨酰内肽酶 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 热循环仪（Bio-Rad S1000 with 384-well reaction module） | Bio-Rad | -- | |
| 高pH反相分级 | 蜘蛛式分级器 | -- | -- |
| LC-MS分析 | EASY-nLC-1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonik | -- | |
| CaptiveSpray纳喷雾离子源 | Bruker Daltonik | -- | |
| ReproSil-Pur C18-AQ硅胶珠 | Dr. Maisch | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 激光显微切割 | 切割精度（实际达到200 nm）、每个样品收集的细胞数（50–100个细胞）、切割偏移量、自动化切割速度（1,250个轮廓/小时） 阅读提示：Methods小节'LMD'和'Fig. 2c,d'图注 |
| 质谱分析 | 质谱仪器型号（timsTOF Pro）、液相色谱系统（EASY-nLC-1200）、梯度（5–30% B in 55分钟，总70分钟）、数据采集模式（ddaPASEF或diaPASEF）、碰撞能量参数 阅读提示：Methods小节'LC–MS analysis' |
| 细胞培养与处理 | 细胞系（U2OS、U2OS FUCCI、Lck-eGFP U2OS）、培养基（DMEM或McCoy's 5A）、血清浓度（10% FBS）、抗生素使用、转染和筛选条件（Geneticin 400 μg/ml） 阅读提示：Methods小节'Cell lines' |
| 组织样本 | 样本来源（涎腺腺泡细胞癌、黑色素瘤、输卵管）、FFPE保存时间（黑色素瘤17年，涎腺癌4年）、切片厚度（2.5 μm）、伦理批准号（SJ-742, REG-066-2019, 13372B） 阅读提示：Methods小节'Patient samples and ethics'和'High-resolution microscopy' |
| 免疫组织化学染色 | 抗原修复条件（pH 9，90°C 60分钟或97°C 24分钟）、抗体稀释比例（EpCAM 1:400，SOX10 1:200，CD146 1:400，SRC 1:3200，FASN 1:100，CNN1 1:300，CK5 1:200）、孵育时间（30分钟，32°C） 阅读提示：Methods小节'IHC staining on membrane slides'和'IHC staining for validation of DVP studies' |