豚鼠植入前胚胎的形态学分期与谱系标志物时空表达
确定豚鼠植入前发育的关键事件时间点及谱系标志物的表达模式
在E3.5-E5.75连续收集体内胚胎，通过明场图像和免疫荧光分析SOX2、SOX17、CDX2、GATA6、GATA3等标志物，并与小鼠和人类胚胎比较
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豚鼠可作为研究人类植入前发育的替代模型
The guinea pig serves as an alternative model to study human preimplantation development.
实验完整度
高结合体内胚胎单细胞转录组、免疫荧光、小分子功能干预及跨物种比较，包含功能验证和机制验证。
主要模型
豚鼠体内植入前胚胎 小鼠体内植入前胚胎 人类体外培养胚胎
重点核对
豚鼠胚胎收集时间：交配后E3.5-E5.75，每阶段至少3只雌性豚鼠 小分子处理浓度：TRULI 7.5 µM（豚鼠）、5 µM（小鼠）；AZD1480 10 µM；PD0325901 1 µM；LY294002 7.5 µM（24 h） 小分子处理时间窗口：TRULI从致密化16细胞期至囊胚期；AZD1480从E4.5至E6.5；PD0325901从16细胞期至囊胚期；LY294002处理24 h scRNA-seq数据质控：保留541个高质量单细胞转录组（来自42个胚胎），要求表达基因>3,000、线粒体基因比例<5%、应激颗粒基因比例<8.5% 免疫荧光细胞计数：盲法计数，每个胚胎分析所有细胞，统计方法为Mann-Whitney或Kruskal-Wallis检验
摘要
植入前发育是人类胚胎发生的重要窗口。然而，伦理限制和研究人类胚胎的局限性往往需要使用替代模型系统。在此，我们将豚鼠确定为研究人类植入前发育的一种有前景的小动物模型。利用单细胞RNA测序，我们构建了豚鼠植入前发育的图谱，揭示了其在致密化、早期、中期和晚期囊胚形成以及植入的时间，以及关键谱系标志物的时空表达方面与早期人类胚胎发生的相似性。我们还展示了Hippo、MEK-ERK和JAK-STAT信号通路的保守作用。此外，多物种分析突出了植入前发育和多能性过程中保守和分化基因的时空表达。豚鼠可作为推进植入前发育和干细胞研究的宝贵动物模型，并可用于更好地理解早期暴露对后代结局的长期影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 豚鼠是否可作为研究人类植入前发育的小动物模型，其早期胚胎发育的分子特征和信号通路与人类有何异同？
- 核心机制
- 豚鼠植入前发育中，Hippo信号通路（LATS1/2）抑制TE程序在ICM中的异位表达，JAK-STAT信号通路参与PE形成和TE成熟，MEK-ERK和PI3K-Akt信号通路参与PE扩增。
- 主要证据
- 通过单细胞RNA测序构建豚鼠植入前发育图谱，免疫荧光验证谱系标志物时空表达，小分子抑制剂（TRULI、AZD1480、PD0325901、LY294002）功能实验，以及跨物种比较分析。
- 研究意义
- 豚鼠可作为研究人类植入前发育和干细胞研究的宝贵动物模型，并可用于理解早期暴露对后代健康的长期影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序构建豚鼠植入前发育转录组图谱
全面表征豚鼠植入前胚胎的基因表达动态和谱系分化轨迹
对E3.5-E6豚鼠胚胎的单个卵裂球进行Smart-Seq2单细胞RNA测序，进行质量控制和降维聚类分析，推断发育轨迹和拟时间
Hippo信号通路在TE形成中的功能验证
验证Hippo信号通路在豚鼠TE形成中的作用
使用LATS抑制剂TRULI处理豚鼠和小鼠胚胎，免疫荧光检测SOX2、aYAP、GATA3表达
JAK-STAT、MEK-ERK和PI3K-Akt信号通路在PE和TE形成中的功能验证
验证JAK-STAT、MEK-ERK和PI3K-Akt信号通路在豚鼠PE形成和TE成熟中的作用
使用JAK抑制剂AZD1480、MEK抑制剂PD0325901和PI3K抑制剂LY294002处理豚鼠胚胎，免疫荧光检测SOX2、SOX17、CDX2、NR2F2表达
TE亚谱系（壁TE和极TE）的鉴定与JAK-STAT功能验证
鉴定豚鼠TE亚谱系的分子特征并验证JAK-STAT在TE成熟中的作用
对TE细胞进行UMAP降维和差异表达分析，免疫荧光验证NR2F2在壁TE中的定位，使用AZD1480处理胚胎检测NR2F2+细胞数量
视黄酸在胚胎附着中的作用
探究视黄酸对豚鼠和人类胚胎附着和定向的影响
在体外培养豚鼠和人类胚胎，添加ATRA，观察胚胎附着和定向
跨物种比较分析
比较豚鼠、人类和小鼠植入前发育的保守性和差异性
整合公共人类和小鼠胚胎scRNA-seq数据，使用CCA和MNN进行跨物种整合，比较谱系标志物和转录因子表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胚胎收集与培养 | M2培养基 | Sigma Aldrich | MR-015-D |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15130122 | |
| Ovoil矿物油 | Vitrolife | 10029 | |
| 胚胎体外培养 | N2B27培养基 | -- | -- |
| KSOM培养基 | Sigma Aldrich | MR-121-D | |
| GTL培养基 | Vitrolife | 10145 | |
| Embryomax矿物油 | Millipore | ES-005-C | |
| 玻璃化复苏试剂盒 | Irvine Scientific | 90137-SO | |
| 小分子处理 | TRULI | Enamine | Z730688380 |
| AZD1480 | -- | -- | |
| PD0325901 | -- | -- | |
| LY294002 | -- | -- | |
| Gö6983 | Tocris | -- | |
| CRT0066854 | -- | -- | |
| 全反式维甲酸 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | Invitrogen | 33342 |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Nunc 72孔迷你托盘 | VWR | CA62409-296 | |
| SecureSeal间隔物 | Grace Bio-Labs | -- | |
| scRNA-seq | TrypLE Express | Gibco, Life Technologies | 12604-013 |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1096 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA FISH | XIST Quasar 570探针 | BioSearch Technologies | SMF-2038-1 |
| Prolong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胚胎性别鉴定 | PicoPLEX全基因组扩增试剂盒 | -- | -- |
| DreamTaq Hot Start Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 成像 | Olympus FV1000MPE共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| Zeiss AxioObserver Z1 Yokogawa CSU-X1转盘共聚焦倒置显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 豚鼠体内胚胎收集 | 胚胎收集时间窗口（E3.5-E5.75）、每阶段至少3只雌性豚鼠、冲取部位（E3.5输卵管，E4-E5.75子宫角） 阅读提示：Methods 'In vivo collection of guinea pig embryos' |
| 小分子处理功能实验 | 各抑制剂的最佳浓度（TRULI 7.5 µM豚鼠/5 µM小鼠；AZD1480 10 µM；PD0325901 1 µM；LY294002 7.5 µM 24 h）、处理时间窗口、对照（DMSO）、培养基（N2B27或DMEM/F12:KSOM 1:1） 阅读提示：Methods 'Functional analysis with small molecules'及Extended Data Fig. 6-7 |
| 单细胞RNA测序 | 胚胎收集阶段和数量（8C n=4, 16C n=7, 16-32C n=4, EB n=6, MB n=16, LB n=14）、Smart-Seq2建库、测序平台NovoSeq6000 S4、质控标准（表达基因>3,000，线粒体基因<5%，应激颗粒基因<8.5%） 阅读提示：Methods 'scRNA-seq library preparation'和'Quality control, normalization and dimensional reduction' |
| 免疫荧光分析 | 抗体列表（Supplementary Table 10）、固定条件（4% PFA 15 min）、透化条件（0.25% Triton X-100 10 min）、封闭条件（3% BSA 2 h）、Hoechst染色、盲法计数方法 阅读提示：Methods 'Immunofluorescence'和Supplementary Table 10 |
| 视黄酸附着实验 | ATRA浓度（20 µM）、培养时间（24 h）、培养条件（豚鼠38.5°C 5% CO2；人类37°C 5% O2 5% CO2）、透明带去除与否 阅读提示：Methods 'Role of retinoic acid in guinea pig embryo apposition'和Extended Data Fig. 8 |
| 跨物种整合分析 | 整合方法（Seurat CCA，top 750特征基因）、MNN分析参数（k=20）、使用的公共数据集（人类GSE171820和E-MTAB-3929；小鼠GSE45719、GSE84892和GSE123046） 阅读提示：Methods 'Pairwise integration of human, mouse and guinea pig data' |