巨噬细胞特异性Sel1L敲除小鼠的构建与表征
验证SEL1L–HRD1 ERAD在巨噬细胞中的功能及其对基础ER稳态的影响。
将Sel1Lflox/flox小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交，获得Sel1LLyz2小鼠；通过Western blot检测巨噬细胞中SEL1L和HRD1蛋白水平，通过TEM观察ER形态，通过Phos-tag Western blot检测IRE1α磷酸化，通过流式细胞术分析免疫细胞组成。
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SEL1L-HRD1内质网相关降解通过限制可激活STING池的大小调控STING介导的天然免疫
SEL1L-HRD1 endoplasmic reticulum-associated degradation controls STING-mediated innate immunity by limiting the size of the activable STING pool.
实验完整度
高包含巨噬细胞特异性基因敲除小鼠、细胞系、多种生化与影像验证，涵盖体外与体内功能及机制验证。
主要模型
髓系特异性Sel1L敲除小鼠（Sel1LLyz2）及其原代巨噬细胞 CRISPR-Cas9构建的Hrd1-/- RAW 264.7细胞 Hrd1-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） KrasLSL-G12D;Trp53LSL-R172H;Pdx1-Cre来源胰腺导管腺癌皮下移植瘤模型
重点核对
Sel1Lfl/fl与Sel1LLyz2小鼠的基因型鉴定及巨噬细胞中SEL1L/HRD1蛋白水平验证 cGAMP、DMXAA、c-di-AMP等STING激动剂处理浓度与时间，以及poly(I:C)、Pam3、LPS等对照激动剂 CHX翻译关闭实验与MG132蛋白酶体抑制实验用于STING蛋白稳定性检测 HSV-1感染的MOI（1或10）及感染时间（6或12小时） 肿瘤模型中DMXAA剂量（12.5 mg/kg体重）及巨噬细胞分泌组注射方案
摘要
干扰素基因刺激因子（STING）响应胞质双链DNA协调促炎细胞因子的产生；然而，新生STING蛋白在内质网（ER）折叠和成熟的病理生理意义及分子机制尚不清楚。本文报道，SEL1L–HRD1蛋白复合物——内质网相关降解（ERAD）最保守的分支——是STING天然免疫的负调控因子，在基础状态下通过泛素化并靶向新生STING蛋白进行蛋白酶体降解。巨噬细胞中SEL1L或HRD1缺陷特异性放大STING信号以及对病毒感染和肿瘤生长的免疫。机制上，新生STING蛋白在基础状态下是SEL1L–HRD1的真正底物，与ER应激或其感受器肌醇需求酶1α无关。因此，本研究不仅确立了SEL1L–HRD1 ERAD通过限制可激活STING池的大小在天然免疫中的关键作用，而且鉴定了靶向STING的调控机制和治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基础状态下内质网中新生STING蛋白如何被调控，以及SEL1L–HRD1 ERAD在STING介导的天然免疫中的作用和机制。
- 核心机制
- SEL1L–HRD1 ERAD在基础状态下直接与新生STING蛋白相互作用并对其进行泛素化，靶向蛋白酶体降解，从而限制可激活STING池的大小；该过程不依赖ER应激、IRE1α和巨噬细胞自噬。
- 主要证据
- 巨噬细胞特异性Sel1L敲除和Hrd1敲除细胞中STING蛋白积累且cGAMP/DMXAA诱导的信号增强；免疫共沉淀和TurboID邻近标记证实STING与SEL1L–HRD1相互作用；HRD1介导STING多泛素化；HSV-1感染和胰腺癌移植瘤模型中Sel1L缺失增强STING依赖性免疫。
- 研究意义
- 确立了SEL1L–HRD1 ERAD在天然免疫中的关键作用，并提出了靶向SEL1L–HRD1 ERAD治疗STING相关疾病的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SEL1L缺失对STING信号通路的影响
确定SEL1L–HRD1 ERAD是否特异性调控cGAS–STING信号。
用TLR2激动剂Pam3、TLR4激动剂LPS、RIG-1激动剂poly(I:C)和STING激动剂cGAMP、c-di-AMP、DMXAA刺激原代巨噬细胞，通过qPCR检测炎症基因表达，ELISA检测分泌的IFNβ和TNFα，Western blot检测TBK1和IRF3磷酸化。
STING蛋白稳定性的检测
验证SEL1L–HRD1 ERAD是否调控STING蛋白的降解。
用CHX处理原代巨噬细胞或Hrd1-/- RAW 264.7细胞进行翻译关闭实验，用MG132处理检测蛋白酶体依赖性，通过Western blot检测STING蛋白水平；在Hrd1-/- MEF中验证STING稳定性。
SEL1L–HRD1与STING相互作用的验证
验证STING是否与SEL1L–HRD1 ERAD复合物直接相互作用。
在野生型巨噬细胞中进行内源性SEL1L和STING免疫共沉淀，在MEF和RAW 264.7细胞中进行SEL1L-TurboID和STING-TurboID邻近标记实验，在HEK293T细胞中转染截短体进行结构域定位。
STING泛素化位点和链类型的鉴定
确定HRD1介导STING泛素化的氨基酸位点和多泛素链拓扑结构。
在HEK293T细胞中共转染STING-Flag、HRD1-myc和Ub-HA，通过免疫共沉淀检测STING泛素化；构建STING的K、S/T、C突变体，检测HRD1介导的泛素化；使用K-only突变体鉴定多泛素链类型。
STING在细胞内的分布和转运分析
验证SEL1L–HRD1 ERAD是否影响STING的细胞内转运。
通过NP-40溶解度实验、蔗糖密度梯度离心和共聚焦显微镜分析STING在ER、反式高尔基体网络（TGN38）、内体（CD63）和溶酶体（LAMP1）中的定位，以及cGAMP刺激后的转运动力学。
SEL1L–HRD1 ERAD在抗病毒和抗肿瘤免疫中的体内验证
评估髓系SEL1L–HRD1 ERAD在HSV-1感染和胰腺癌移植瘤模型中的病理生理意义。
用HSV-1感染巨噬细胞，检测Ifnb表达和IFNβ分泌；在皮下移植KrasLSL-G12D;Trp53LSL-R172H;Pdx1-Cre胰腺导管腺癌细胞的小鼠中，注射DMXAA或DMXAA处理的巨噬细胞分泌组，监测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 毒胡萝卜素 | EMD Calbiochem | -- |
| 牛磺熊去氧胆酸钠 | MedChemExpress | -- | |
| 巴弗洛霉素A1 | Selleck Chemicals | -- | |
| 4μ8c | MedChemExpress | -- | |
| Pam3Cys | InvivoGen | -- | |
| 脂多糖 | InvivoGen | -- | |
| 2'3'-环鸟苷酸-腺苷酸 | InvivoGen | -- | |
| 环二腺苷酸 | InvivoGen | -- | |
| 5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸 | MedChemExpress | -- | |
| 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | -- | |
| H151 | InvivoGen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫共沉淀 | Protein A琼脂糖珠 | Invitrogen | 20334 |
| 抗FLAG琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| 抗Myc琼脂糖 | Sigma-Aldrich | 16-219 | |
| 链霉亲和素琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Western blot | HSP90抗体 | Abcam | ab13492 |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 8G10 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9242 | |
| SEL1L抗体 | Abcam | ab78298 | |
| BiP抗体 | Abcam | ab21685 | |
| HRD1抗体 | Proteintech | 13473-1-AP | |
| STING抗体 | Proteintech | 19851-1AP | |
| STING抗体 | Cell Signaling Technology | D2P2F | |
| 磷酸化Ser365 STING抗体 | Cell Signaling Technology | D8F4W | |
| cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | D3080 | |
| 磷酸化Ser172 TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | D52C2 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | E9H5S | |
| 磷酸化Ser396 IRF-3抗体 | Cell Signaling Technology | D601M | |
| IRF-3抗体 | Cell Signaling Technology | D83B9 | |
| ATG7抗体 | Cell Signaling Technology | D12B11 | |
| OS9抗体 | Abcam | ab109510 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9722 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 3597S | |
| IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| ERP44抗体 | Cell Signaling Technology | 2886 | |
| STIM1抗体 | Cell Signaling Technology | 4916 | |
| HA抗体 | Sigma-Aldrich | H3663 | |
| c-Myc抗体 | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| H2A抗体 | Cell Signaling Technology | 2578 | |
| LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775 | |
| PDI抗体 | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-890 | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | P4D1 | |
| SOAT1抗体 | GeneTex | GTX32890 | |
| FACL4抗体 | Abcam | ab155282 | |
| 钙联蛋白抗体 | Proteintech | 10427-2-AP | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Bio-Rad | 1721019 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Bio-Rad | 1721011 | |
| 流式细胞术 | CD4抗体 | BioLegend | 100408 |
| CD8抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-17605,MA5-17607 | |
| F4/80抗体 | BioLegend | 123116 and 123114 | |
| CD11b抗体 | BioLegend | 101206 | |
| Gr-1抗体 | BioLegend | 108408 | |
| TCRβ抗体 | BioLegend | 109206 | |
| B220抗体 | BioLegend | 103206 and 103208 | |
| CD45抗体 | BioLegend | 103130 | |
| I-A/I-E抗体 | BioLegend | 107645 and 107608 | |
| H-2Kb/H-2Db抗体 | BioLegend | 114606 and 116506 | |
| TLR2抗体 | BioLegend | 148604 | |
| TLR4抗体 | BioLegend | 145406 | |
| PD-L1抗体 | BioLegend | 124308 | |
| 抗CD16/CD32抗体 | BioLegend | 101302 | |
| BD Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒 | BD | -- | |
| 免疫荧光 | STING抗体 | Proteintech | 19851-1AP |
| KDEL抗体 | Abcam | MAC 256 | |
| 磷酸化Ser365 STING抗体 | Cell Signaling Technology | D1C4T | |
| TGN38抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166594 | |
| CD63抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5275 | |
| LAMP1抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂/DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | TNFα ELISA试剂盒 | eBioscience or BioLegend | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | eBioscience or BioLegend | -- | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | eBioscience or BioLegend | -- | |
| IL-2 ELISA试剂盒 | eBioscience or BioLegend | -- | |
| IFNβ ELISA试剂盒 | eBioscience or BioLegend | -- | |
| 胰岛素ELISA试剂盒 | Crystal Chem | -- | |
| 动物实验 | 硫羟乙酸盐肉汤 | VWR | 90000-294 |
| 高脂饲料D12492 | Research Diets | D12492 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| OneTouch Ultra血糖仪 | -- | -- | |
| T细胞激活 | OVA257-264肽（SIINFEKL） | Biomatik | -- |
| α-半乳糖神经酰胺 | Toronto Research Chemicals | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞特异性Sel1L敲除小鼠构建 | Sel1Lflox/flox与Lyz2-Cre杂交策略；巨噬细胞中SEL1L和HRD1蛋白敲除效率验证；小鼠背景（C57BL/6J） 阅读提示：Methods 'Mice'小节及Extended Data Fig. 1a,b |
| STING激动剂刺激实验 | cGAMP、c-di-AMP、DMXAA的处理浓度和时间；poly(I:C)、Pam3、LPS的对照浓度；转染试剂lipofectamine 2000的使用 阅读提示：Methods 'Drug treatment'小节及Figure 2图注 |
| STING蛋白稳定性检测 | CHX浓度（50 μg/ml）和处理时间（6小时）；MG132浓度（25 μM）和处理时间（6小时）；Hrd1-/-细胞系来源 阅读提示：Methods 'Drug treatment'小节及Figure 3e,f图注 |
| HSV-1感染实验 | HSV-1的MOI（1或10）；感染时间（6或12小时）；STING抑制剂H151预处理条件 阅读提示：Methods 'HSV-1 infection'小节及Figure 7d,e、Extended Data Fig. 8图注 |
| 肿瘤移植和分泌组治疗实验 | 肿瘤细胞数量（5.0×10^5或3.5×10^5）；DMXAA剂量（12.5 mg/kg体重）和注射时间（第7、10天）；巨噬细胞分泌组体积（0.5 ml，1百万巨噬细胞）；热灭活条件（80°C，20分钟）；裸鼠背景 阅读提示：Methods 'In vivo tumour study'小节及Figure 7f-h、Extended Data Fig. 9图注 |