葡萄糖状态调控YAP磷酸化与定位
验证葡萄糖代谢是否调控Hippo通路效应分子YAP
HEK293A细胞葡萄糖饥饿后给予25 mM葡萄糖、D-葡萄糖或2-DG，Western blot检测YAP S127磷酸化，免疫染色检测YAP亚细胞定位，并用2-DG浓度梯度处理。
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AMPK调节Hippo通路活性以调控能量稳态
AMPK modulates Hippo pathway activity to regulate energy homeostasis.
实验完整度
高包含细胞系、MEFs、小鼠肝脏及人癌组织多层级证据，并有磷酸化位点、基因转录等功能与机制验证
主要模型
HEK293A细胞 MCF10A细胞 AMPKα敲除MEF与野生型MEF C57/B6小鼠禁食-复食肝脏模型 人结肠癌与肝癌组织芯片
重点核对
HEK293A细胞葡萄糖饥饿及25 mM葡萄糖或2-DG处理的时间梯度 2-DG浓度梯度处理4小时及磷酸化tag凝胶检测YAP磷酸化 AMPKα敲除与野生型MEF中2-DG处理4小时后YAP S61磷酸化检测 小鼠禁食16小时后喂食或继续禁食5小时，每组n=3，检测肝脏YAP磷酸化与核定位 YAP-5SA细胞中GLUT3敲低后检测培养基酸化、2-NBDG摄取和乳酸生成
摘要
Hippo通路最初被发现是一个限制细胞增殖和凋亡的保守肿瘤抑制通路。然而，在器官大小控制和癌症预防背景下调控Hippo通路的上游信号在很大程度上仍不清楚。在此，我们报道葡萄糖，这一用于ATP生成的广泛能量来源，调控Hippo通路下游效应分子YAP。我们发现，在葡萄糖饥饿期间，Hippo通路和AMP活化蛋白激酶（AMPK）均被激活，导致YAP磷酸化并促进其失活。我们还鉴定出葡萄糖转运蛋白3（GLUT3）是YAP调控的、参与葡萄糖代谢的基因。总之，这些结果表明葡萄糖介导的能量稳态是调控Hippo通路的上游事件，并可能涉及YAP促进糖酵解的致癌功能，从而在组织维持和癌症预防中为葡萄糖代谢与Hippo通路之间提供了令人兴奋的联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在器官大小控制和癌症预防背景下，调控Hippo通路的上游信号是什么？
- 核心机制
- 能量应激激活AMPK和Hippo通路，AMPK直接磷酸化YAP多个位点（包括S61），Hippo通路经LATS磷酸化YAP S127，共同抑制YAP转录活性；YAP-TEAD转录上调GLUT3促进糖酵解。
- 主要证据
- 葡萄糖饥饿、2-DG和AICAR处理细胞中YAP磷酸化与定位改变；AMPK与YAP结合并磷酸化S61；AMPK敲除MEF中YAP活性升高；小鼠禁食-复食肝脏中YAP磷酸化与核转位变化；YAP-5SA细胞中GLUT3上调并增强糖酵解，GLUT3敲低部分逆转。
- 研究意义
- 揭示葡萄糖代谢与Hippo通路之间的交叉调控，提出YAP通过促进葡萄糖摄取和糖酵解发挥致癌功能，为组织维持和癌症预防提供新联系。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
能量应激释放激活YAP
验证能量应激解除是否激活YAP转录功能
HEK293A和MCF10A细胞经葡萄糖饥饿、AICAR（0.5 mM）或2-DG（25 mM）诱导能量应激16小时后释放1小时，检测YAP定位、磷酸化、与14-3-3和TEAD1的相互作用及下游基因转录。
小鼠禁食-复食模型验证YAP活性
验证能量稳态对YAP活性的生理相关性
C57/B6小鼠禁食16小时后喂食或继续禁食5小时，收集肝脏进行Western blot、免疫组化和qPCR检测YAP磷酸化、核定位及下游基因转录。
AMPK与YAP结合并磷酸化YAP
鉴定能量应激调控YAP的机制
葡萄糖饥饿HEK293A细胞中串联亲和纯化结合质谱鉴定YAP结合蛋白，pulldown验证AMPK与YAP结合，共表达AMPK活性截短体或失活突变体检测YAP磷酸化迁移。
鉴定AMPK磷酸化YAP的位点
确定AMPK直接磷酸化YAP的氨基酸位点
通过YAP-5SA及系列回复突变体共表达、体外激酶 assay 和质谱鉴定AMPK磷酸化位点，并用YAP S61磷酸化特异性抗体在野生型与AMPKα敲除MEF中验证。
AMPK与Hippo通路平行磷酸化YAP
区分AMPK与Hippo通路对YAP磷酸化的贡献
检测AMPK活性对YAP S127磷酸化、LATS1和MST1磷酸化的影响，并在LATS1/2或MST1/2双敲除细胞中检测2-DG诱导的YAP S127磷酸化。
能量应激经Rho GTPase和细胞骨架激活LATS
探究能量应激激活LATS激酶的机制
在能量应激释放细胞中预处理latrunculin B或Rho抑制剂C3，检测YAP S127磷酸化；用GST-Rhotekin-RBD pulldown检测Rho GTPase活性。
YAP调控GLUT3转录并促进糖酵解
验证YAP对葡萄糖代谢的功能影响及GLUT3的作用
比较YAP-5SA与对照细胞培养基酸化、葡萄糖摄取和乳酸生成，qPCR筛选葡萄糖代谢相关基因，检测GLUT3转录和蛋白，敲低GLUT3后检测糖酵解指标。
人癌组织中YAP与GLUT3表达相关性
评估YAP与GLUT3在人类癌症中的相关性
人结肠癌和肝癌组织芯片进行YAP和GLUT3免疫组化染色，分析表达相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证基因转录变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗YAP抗体 | -- | -- |
| 抗YAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc101199 | |
| 抗磷酸化YAP (S127)抗体 | Cell Signaling Technology | 4911S | |
| 抗α-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T6199-200UL | |
| 抗flag (M2)抗体 | Sigma-Aldrich | F3165-5MG | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗GST抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-138 | |
| 抗14-3-3θ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-732 | |
| 抗TEAD1抗体 | Millipore | 610922 | |
| 抗磷酸化AKT1 (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 9271S | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9100S | |
| 抗磷酸化ACC (Ser79)抗体 | Cell Signaling Technology | 3661S | |
| 抗ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3662S | |
| 抗磷酸化p70 S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9205S | |
| 抗磷酸化AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2531S | |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532S | |
| 抗磷酸化LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 8654S | |
| 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 9153S | |
| 免疫沉淀 | 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477S |
| Western blot | 抗磷酸化MST1/MST2抗体 | Cell Signaling Technology | 3681S |
| 抗MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 3682S | |
| 抗GLUT3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-30107 | |
| 抗RhoA抗体 | Cytoskeleton, Inc. | ARH03-A | |
| GST pulldown | GST-Rhotekin-RBD蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | RT01-A |
| 免疫组化 | 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 4912S |
| 抗GLUT3抗体 | Sigma | HPA006539 | |
| 亲和纯化 | 链霉亲和素偶联磁珠 | Amersham | -- |
| S蛋白磁珠 | Novagen | -- | |
| 抗体纯化 | AminoLink Plus固定化与纯化试剂盒 | Pierce | -- |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 聚brene | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 葡萄糖摄取 | 2-NBDG | Invitrogen | -- |
| 乳酸生成 | Lactate Plus检测试纸 | Nova Biomedical | -- |
| Lactate Plus检测仪 | Nova Biomedical | -- | |
| RNA提取与逆转录 | TRIZOL试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| qPCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| 免疫组化 | 抗原修复液 | Vector Laboratories | -- |
| SignalStain Boost检测试剂 | Cell Signaling Technology | -- | |
| SignalStain DAB显色剂 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 免疫荧光 | 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 葡萄糖饥饿与2-DG处理 | HEK293A细胞葡萄糖饥饿时间梯度；葡萄糖或2-DG浓度25 mM；处理时间4小时或16小时 阅读提示：Figure 1A–1E图注及Methods细胞培养部分 |
| AMPKα敲除MEF验证YAP S61磷酸化 | 野生型与AMPKα敲除MEF来源；2-DG 25 mM处理4小时；YAP免疫沉淀与S61磷酸化抗体 阅读提示：Figure 4E图注及Methods抗体部分 |
| 小鼠禁食-复食实验 | 5周龄C57/B6雌性小鼠；禁食16小时后喂食或继续禁食5小时；每组n=3；肝脏采集 阅读提示：Figure 2E–2G图注及Methods小鼠禁食实验部分 |
| YAP-5SA细胞糖酵解检测 | YAP-5SA稳定表达细胞；2-NBDG 50 μM处理1小时；乳酸检测方法；n=3生物学重复 阅读提示：Figure 6A–6Q图注及Methods葡萄糖摄取和乳酸生成assay部分 |
| GLUT3敲低实验 | GLUT3 shRNA序列TRCN0000043615和TRCN0000042880；敲低效率验证；糖酵解指标检测 阅读提示：Figure 6M–6Q图注及Methods构建与病毒部分 |