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        MEK相互作用调节RAF激酶对构象选择性抑制的敏感性

        MEK interactions tune RAF kinase sensitivity to conformation-selective inhibition.

        作者信息Ethan G Stoddard, B Gayani K Perera, Linglan Fang, Daniel S Brush, Yuhao Zhong, Zachary E Potter, Jessica J Simon, Martin Golkowski, Dustin J Maly
        PMID42120500
        期刊Nat Chem Biol
        发布时间2026-05-12
        DOI10.1038/s41589-026-02212-2
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        使用多种突变KRas细胞系、CIAR-293工程细胞系、结构分析及生化实验，包含功能验证和机制验证。

        主要模型

        突变KRas表达的癌细胞系（HCT-116、MDA-MB-231、MDA-MB-453、Mia PaCa-2等） CIAR-293工程细胞系（可诱导Ras激活） 稳定表达HA-BRaf WT/G615R/G615H的CIAR-293细胞

        重点核对

        LXH-254处理时间：4小时（部分实验为3小时或24小时） LXH-254浓度梯度：初始10 μM，3倍或5倍系列稀释 pErk IC50和BRaf:CRaf二聚化DC50的测定 cobimetinib预处理浓度：40 nM或240 nM等，处理1小时后再加LXH-254 3小时 encorafenib预处理：1 μM处理1小时，洗脱1小时后再加LXH-254

        摘要

        Raf激酶是Ras-Raf-Mek-Erk信号通路中的关键效应分子，使其成为癌症治疗开发的重要靶点。本研究探讨了DFG-out稳定型Raf抑制剂在表达突变KRas的细胞系中效价可变的现象。我们证明抑制剂效价与基础Raf活性相关，活性更高的Raf对抑制更敏感。我们进一步表明，DFG-out稳定型抑制剂破坏高亲和力Raf-Mek相互作用，促进形成被抑制的Raf二聚体。此外，我们鉴定出cobimetinib作为一种Mek抑制剂，通过破坏自抑制的Raf:Mek复合物，独特地使Raf激酶对DFG-out稳定型抑制剂敏感。基于这一见解，我们开发了具有增强增敏特性的cobimetinib类似物。我们的发现为理解DFG-out稳定型抑制剂敏感性的细胞决定因素提供了机制框架，并为优化协同Raf-Mek抑制剂组合提供了策略。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        DFG-out稳定型Raf抑制剂在突变KRas表达细胞中效价差异的细胞决定因素是什么？Mek抑制剂如何调节Raf对该类抑制剂的敏感性？
        核心机制
        DFG-out稳定型抑制剂通过破坏自抑制的Raf:Mek复合物，将单体Raf招募为二聚体；基础Raf活性越高，自抑制复合物越易被破坏，抑制剂效价越高。cobimetinib通过破坏高亲和力Raf:Mek相互作用独特地增敏，而其类似物可进一步增强此效应。
        主要证据
        在多种突变KRas细胞系中测定pErk IC50，发现其与基础pMek/pErk水平负相关；CIAR-293细胞中A115激活Ras后LXH-254效价提高4倍；免疫共沉淀显示LXH-254破坏BRaf:Mek结合；cobimetinib预处理增强LXH-254效价并破坏Raf:Mek复合物；BRaf G615R突变减弱Mek结合并增敏。
        研究意义
        提供了理解DFG-out稳定型抑制剂敏感性细胞决定因素的机制框架，并为优化协同Raf-Mek抑制剂组合提供了策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        评估DFG-out稳定型Raf抑制剂在突变KRas细胞系中的效价差异

        确定LXH-254等抑制剂在不同突变KRas细胞系中的pErk IC50范围及时间依赖性

        用LXH-254处理11种突变KRas细胞系4小时，Western blot检测pErk并计算IC50；部分细胞系处理24小时验证相对差异；用LF-268、AZ628、tovorafenib进行类似滴定并比较相关性。

        2

        分析基础Raf活性与抑制剂敏感性的相关性

        检验基础pMek/pErk水平是否与pErk IC50相关

        在6种突变KRas细胞系中检测ARaf、BRaf、CRaf、Mek、Erk的表达和磷酸化水平，与pErk IC50进行相关性分析；在CIAR-293细胞中用A115激活Ras，比较LXH-254的pErk IC50和pMek水平。

        3

        测量抑制剂促进的BRaf:CRaf二聚化及与Mek的结合

        确定LXH-254促进BRaf:CRaf异二聚化的DC50及其与pErk IC50的关系，并检测对Raf:Mek复合物的影响

        用LXH-254处理细胞，免疫共沉淀BRaf并检测共沉淀的CRaf，计算DC50；免疫共沉淀Mek并检测共沉淀的BRaf/CRaf，计算CC50；SEC分析LXH-254对BRaf、CRaf、Mek共洗脱的影响。

        4

        利用encorafenib预占据第一protomer评估第二protomer结合

        测试LXH-254在单抑制剂占据的Raf二聚体中的pErk IC50，以反映第二protomer结合

        用encorafenib（1 μM）预处理细胞1小时，洗脱1小时，然后加入LXH-254梯度处理3小时，检测pErk IC50；比较不同细胞系。

        5

        筛选协同作用的Mek抑制剂并验证cobimetinib的独特增敏机制

        鉴定能增强DFG-out稳定型抑制剂效价的Mek抑制剂，并探究其机制

        用5种Mek抑制剂（cobimetinib、trametinib、binimetinib、CH5126766、GDC-0623）的约85%抑制剂量预处理Mia PaCa-2细胞1小时，然后加入LXH-254梯度处理3小时，检测pErk IC50；进一步用cobimetinib梯度预处理MDA-MB-453细胞，Bliss分析协同性；免疫共沉淀检测Raf:Mek相互作用；SEC分析。

        6

        设计并测试cobimetinib类似物对DFG-out抑制剂增敏的增强效果

        验证通过修饰cobimetinib的取代基可增强其破坏Raf:Mek相互作用和增敏的能力

        合成系列cobimetinib类似物（化合物11-15），测定其约85%抑制剂量，预处理Mia PaCa-2细胞1小时，然后加入LXH-254处理3小时，检测pErk IC50；免疫共沉淀检测Raf:Mek相互作用。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹免疫共沉淀尺寸排阻色谱
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹
        验证机制链路
        免疫共沉淀尺寸排阻色谱TurboID邻近标记
        数据分析与统计
        Bliss协同分析Pearson相关性分析Student t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        药物处理AZ628MedChem ExpressHY-11004
        托沃拉非尼MedChem ExpressHY-15246
        丹诺普韦ApexBioA4024
        A-1155463ChemieTekCT-A115
        LXH-254Selleck ChemicalsS8745
        维莫非尼Selleck ChemicalsS1267
        考比替尼MedChem ExpressHY-13064
        比美替尼MedChem ExpressHY-15202
        CH5126766MedChem ExpressHY-18652
        曲美替尼MedChem ExpressHY-10999
        恩科拉非尼MedChem ExpressHY-15605
        GDC-0623MedChem ExpressHY-15610
        细胞培养DMEM培养基ThermoFisher--
        胎牛血清Millipore Sigma--
        McCoy's培养基ThermoFisher--
        Western blotMEK1 61B12小鼠单克隆抗体Cell Signaling Technology2352
        磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) D13.14.4E XP兔单克隆抗体Cell Signaling Technology4370
        p44/42 MAPK (Erk1/2) (3A7)小鼠单克隆抗体Cell Signaling Technology9107
        磷酸化MEK1/2 (Ser217/221) (41G9)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology9154
        c-Raf (D4B3J)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology53745
        磷酸化c-Raf (Ser338) (56A6)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology9427
        磷酸化c-Raf (Ser259)抗体Cell Signaling Technology9421
        磷酸化c-Raf (Ser289/296/301)抗体Cell Signaling Technology9431
        磷酸化B-Raf (Ser445)抗体Cell Signaling Technology2696
        磷酸化c-Raf (Ser621)多克隆抗体Invitrogen44-504G
        免疫共沉淀Protein A琼脂糖珠Cell Signaling Technology9863
        Protein G琼脂糖珠Cell Signaling Technology37478
        Western blot14-3-3 (pan) E9S9M兔单克隆抗体Cell Signaling Technology95422
        BRaf抗体 (F-7)Santa Cruz Biotechnology5284
        兔源抗磷酸化B-Raf-T401抗体Sigma AldrichSAB5701867
        ARaf抗体 (A-5)Santa Cruz Biotechnology166771
        抗Mek1抗体Sigma-Aldrich07-641
        纯化小鼠抗MEK1克隆25/MEK1BD Biosciences610122
        GAPDH抗体 (A-3)Santa Cruz Biotechnology137179
        小鼠IgG2a同型对照 (PPV-04)Thermo Scientific via InvitrogenMA1-10418
        正常兔IgGSigma Aldrich12-370
        IRDye® 680RD山羊抗小鼠IgG二抗LI-COR Biosciences926-68070
        IRDye® 800CW山羊抗兔IgG二抗LI-COR Biosciences926-32211
        免疫共沉淀Pierce™抗HA磁珠ThermoFisher Scientific88836

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        Raf抑制剂滴定
        LXH-254处理时间（4小时或24小时）、浓度梯度（初始10 μM，3倍系列稀释）、细胞密度（80-90%或50%汇合度）
        阅读提示：Methods: Raf inhibitor titrations in mutant KRas-expressing cell lines
        CIAR-293细胞激活与抑制
        A115浓度（100 nM）、血清饥饿时间（18小时）、LXH-254处理时间（3小时）及浓度梯度
        阅读提示：Methods: Inhibitor titrations in CIAR-293 cells
        免疫共沉淀检测BRaf:CRaf二聚化
        LXH-254浓度梯度（初始50 μM或10 μM，5倍稀释）、处理时间（3-4小时）、抗体用量（5 μg/20 μL珠浆）
        阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation of CRaf with BRaf in mutant KRas-expressing cells after LXH-254 treatment
        Mek抑制剂与LXH-254联合处理
        Mek抑制剂预处理浓度（如cobimetinib 40 nM、CH5126766 6 nM等）、预处理时间（1小时）、LXH-254后续处理3小时
        阅读提示：Methods: Raf inhibitor and Mek inhibitor cotreatments in mutant KRas-expressing cell lines
        encorafenib预占据实验
        encorafenib浓度（1 μM）、处理时间（1小时）、洗脱时间（1小时）、LXH-254梯度（初始10 μM，3倍稀释）处理3小时
        阅读提示：Methods: Encorafenib and LXH-254 cotreatment protocol

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