Gαs结合肽的生化鉴定
确定GαsBP1和GαsBP2是否优先结合活性Gαs并影响其核苷酸结合与水解。
用GST融合肽进行pulldown，结合GDP、GDP-AlF4−或GTPγS负载的纯化牛Gαs；用荧光偏振测定KD；用[35S]GTPγS结合和单周转GTPase实验检测肽对Gαs活性的影响。
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用于Gαs蛋白信号时空分析的抑制性探针
Inhibitory probes for spatiotemporal analysis of Gαs protein signaling.
实验完整度
高包含体外纯化蛋白生化实验、HEK293T细胞模型、原代小鼠心肌细胞及人CD8+ T细胞，并进行功能与机制验证
主要模型
HEK293T细胞 原代小鼠新生儿心肌细胞 人CD8+ T细胞 纯化Gαs蛋白及AC催化结构域
重点核对
GαsBP1/GαsBP2与Gαs的结合选择性及亲和力（KD约1 μM） mem-GαsBP2在HEK293T细胞中抑制异丙肾上腺素刺激的cAMP反应 endo-GαsBP2对PTH1-34诱导的持续cAMP反应及β2AR转录反应的影响 α-sintide对小鼠心肌细胞肾上腺素刺激PLB磷酸化的抑制 α-sintide对人CD8+ T细胞PGE2处理后IL-2+/IFNγ+和IL-2+/TNFα+比例的影响
摘要
Gαs是G蛋白偶联受体（GPCR）的典型信号转导子，也是在癌症中最常发生突变的异三聚体G蛋白。质膜是GPCR信号转导发生的唯一细胞定位这一经典观点，已受到提示Gs也可从细胞内区室发出信号的证据的挑战。然而，由于缺乏具有足够时空分辨率的方法，该主题的进展停滞不前。在此，我们描述了基因编码探针和细胞穿透化合物，它们能在细胞中阻断活性Gαs的效应器结合位点，从而在离散的亚细胞位置、用户指定的时间以及多种实验条件下阻止信号传播。利用这些工具，我们展示了Gαs介导的信号在细胞内细胞器上发生的直接证据、Gαs癌突变体信号传导的独特时空特征，以及对心脏或免疫细胞中生理相关反应的特异性调节。这些发现为利用Gs信号的时空调节及其未开发的治疗潜力铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现Gαs信号在亚细胞定位和时间上的特异性抑制，并以此探究Gαs在细胞内区室及癌突变体中的信号特征。
- 核心机制
- GαsBP2通过结合活性Gαs的α3/SwII沟槽，竞争性阻断Gαs与腺苷酸环化酶的效应器结合位点；膜锚定GαsBP2还可将Gαs R201C招募至质膜并促使其与Gβγ形成失活复合物。
- 主要证据
- 利用纯化蛋白结合、荧光偏振、GTPγS结合、单周转GTPase和体外AC活性实验验证肽的作用；在HEK293T细胞中用BRET、cAMP发光检测、FRT和RT-qPCR验证亚细胞定位抑制；在原代小鼠心肌细胞和人CD8+ T细胞中验证α-sintide的生理相关效应。
- 研究意义
- 提供了具有高时空分辨率的Gαs抑制性探针，为直接研究GPCR-G蛋白信号的时空编码及癌症中Gαs信号的选择性靶向提供了工具和概念验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GαsBP2对AC活性的竞争性抑制及G蛋白选择性
验证肽是否竞争性抑制Gαs刺激的AC活性，并评估其对不同G蛋白家族的选择性。
将纯化AC5 C1和AC2 C2结构域与Gαs-GTPγS或forskolin共孵育，检测cAMP生成；用GST pulldown和BRET检测肽与Gαs、Gαi3、Gαo、Gαz、Gαq、Gα13的结合。
亚细胞定位GαsBP2对cAMP信号的抑制
比较胞质、质膜和内体靶向GαsBP2对GPCR刺激cAMP反应的抑制效果。
在HEK293T细胞中转染cyto-、mem-或endo-GαsBP2-mKate2，用Glosensor发光检测异丙肾上腺素、PTH1-34或forskolin刺激后的cAMP动力学。
GαsBP2对β2AR转录反应及ERK磷酸化的影响
验证内体Gαs信号对β2AR诱导基因转录和ERK1/2激活的作用。
在HEK293T细胞中转染不同GαsBP2构建体，异丙肾上腺素刺激后RT-qPCR检测PCK1、FOS、DUSP1 mRNA，免疫印迹检测ERK1/2磷酸化。
GαsBP2对癌突变体Gαs R201C信号的抑制及机制
探究Gαs R201C的GTP结合形式在信号传导中的作用及膜锚定GαsBP2对其亚细胞分布和Gβγ结合的影响。
在HEK293T细胞中共表达Gαs R201C和mem-或cyto-GαsBP2，检测cAMP；用BRET检测Gαs与膜、游离Gβγ的关联；用pulldown检测肽与核苷酸负载Gαs R201C的结合。
细胞穿透性α-sintide的理性设计与优化
提高GαsBP2的细胞穿透性和抑制效力。
将GαsBP2与TAT序列融合，引入S9A突变和E10–S17烃钉合，合成系列肽，在HEK293T细胞中检测对异丙肾上腺素或Gαs R201C诱导cAMP的抑制。
α-sintide在生理相关细胞中的验证
验证α-sintide对心肌细胞肾上腺素反应和CD8+ T细胞细胞因子产生的影响。
原代小鼠新生儿心肌细胞经α-sintide预处理后肾上腺素刺激，免疫印迹检测PLB磷酸化；慢性激活的人CD8+ T细胞经α-sintide预处理后PGE2刺激，流式检测IL-2+/IFNγ+和IL-2+/TNFα+细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白-蛋白相互作用
验证亚细胞定位
多肽合成与结构建模
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | HisPur钴树脂 | ThermoFisher | 89964 |
| 谷胱甘肽琼脂糖树脂 | Thermo | 16100 | |
| 镍-次氮基三乙酸树脂 | Qiagen | 30210 | |
| HiTrap脱盐柱 | Cytiva | 29048684 | |
| cAMP检测 | Glosensor 22F质粒 | Promega | E2301 |
| LANCE cAMP试剂盒 | Perkin Elmer | AD0262 | |
| D-荧光素钾盐 | GoldBio | LUCK-100 | |
| BRET检测 | Nano-Glo荧光素酶底物 | Promega | N1120 |
| 呋喃嗪 | ChemShuttle | 185252 | |
| CTZ400a荧光素酶底物 | GoldBio | C-320-1 | |
| RT-qPCR | RNAqueous总RNA分离试剂盒 | ThermoFisher | AM1912 |
| LunaScript逆转录预混液 | New England BioLabs | E3010 | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied biosystems | 4385612 | |
| 免疫荧光 | RFP抗体 | Invitrogen | MA5-15257 |
| EEA1抗体 | Cell Signaling Technology | 3288 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11070 | |
| 山羊抗鼠Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36965 | |
| 免疫印迹 | His抗体 | Sigma | H1029 |
| GFP抗体 | Clontech | 632380 | |
| Gαs抗体（c-18） | SCBT | sc-383 | |
| Gβ抗体（H-1） | SCBT | sc-166123 | |
| Nluc抗体 | Promega | N7000 | |
| 微管蛋白抗体 | LiCor Biosciences | 926-42211 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| 磷酸化p44/42 MAPK ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| p44/42 MAPK (ERK1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| β-肌动蛋白抗体 | LiCor Biosciences | 926-42210 | |
| 心肌细胞免疫印迹 | 磷酸化受磷蛋白(S16/T17)抗体 | Cell Signaling Technology | 8496 |
| 受磷蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 14562 | |
| 钙sequestrin 2抗体 | Proteintech | 18422-1-AP | |
| 流式细胞术 | IL-2-PE抗体 | BioLegend | 500307 |
| IFNγ-APC抗体 | BioLegend | 502512 | |
| TNFα-BV510抗体 | BioLegend | 502950 | |
| CD8+ T细胞分离 | CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 30-096-495 |
| CD8+ T细胞激活 | CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-131-D |
| 药物处理 | 毛喉素 | Tocris Bioscience | 1099 |
| 雷帕霉素 | Alfa Aesar | J62473 | |
| (S)-(+)-脱落酸 | TCI | A1698 | |
| 前列腺素E2 | Cayman | 14010 | |
| 血管活性肠肽 | Tocris Bioscience | 1911 | |
| 阿普洛尔 | Tocris Bioscience | 2806 | |
| 溴莫尼定 | Ark Pharm | AK-3579 | |
| 卡巴胆碱 | Acros Organics | AC-10824 | |
| 凝血酶受体激活肽6 | Anaspec | AS-24190 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GαsBP2亚细胞定位抑制cAMP | HEK293T细胞转染量、Glosensor 22F 0.8 μg/孔、异丙肾上腺素100 nM、forskolin 10 μM、PTH1-34刺激1 min、独立实验重复数 阅读提示：Methods“Luminescence-based cAMP measurements in cells”及Fig. 2、Fig. 3A图注 |
| α-sintide在心肌细胞中的验证 | 原代小鼠新生儿心肌细胞来源（P1-2 C57BL/6）、α-sintide 10 μM预处理2 h、肾上腺素1 μM刺激15 min、PLB磷酸化检测抗体及独立实验n=6 阅读提示：Methods“Mouse neonatal cardiomyocyte isolation and culture”及Fig. 6C图注 |
| α-sintide在CD8+ T细胞中的验证 | 人CD8+ T细胞慢性激活方案、α-sintide 30 μM预处理2 h、PGE2 5 μM刺激24 h、流式抗体及独立实验n=3 阅读提示：Methods“CD8+ T cell isolation, activation, and flow cytometry analysis”及Fig. 6D图注 |
| Gαs R201C信号抑制及BRET检测 | Gαs R201C质粒50 ng/孔、mem-或cyto-GαsBP2梯度表达量、BRET供体与受体配对、独立实验重复数 阅读提示：Methods“Luminescence-based cAMP measurements in cells”及“Detection free Gβγ in cells using BRET”，Fig. 4、Fig. 5图注 |
| 体外AC活性实验 | AC5 C1 50 nM、AC2 C2 0.5 μM、Gαs-GTPγS 0.1 μM、forskolin 10 μM、ATP 1 mM、肽浓度范围0–100 μM 阅读提示：Methods“Adenylyl cyclase activity in vitro”及Fig. 2A图注 |