b-isox沉淀筛选相分离蛋白
筛选精子发生中潜在形成无膜细胞器的相分离蛋白
用b-isox从不同发育阶段小鼠睾丸提取物中沉淀蛋白，鉴定共享蛋白并做GO和PrLD预测
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LENG8颗粒调控哺乳动物可变多聚腺苷化
LENG8 granule regulates alternative polyadenylation in mammals.
实验完整度
高包含细胞系、条件敲除小鼠、睾丸组织、scRNA-seq、QuantSeq 3′mRNA-seq、m⁶A-seq、RIP/CLIP-seq、体外相分离及回补实验等多层级功能与机制验证
主要模型
293T、HeLa、MCF7等培养细胞系 LENG8条件敲除小鼠（Stra8-Cre） 小鼠睾丸组织及生殖细胞 HA-LENG8敲入小鼠
重点核对
LENG8 cKO小鼠睾丸中LENG8蛋白显著降低，雄性不育且睾丸重量减小（n=12） QuantSeq 3′mRNA-seq检测PDUI变化，组织阈值p<0.05且|ΔPDUI|>0.2 LENG8Δ24-66相分离缺陷突变体无法回补近端poly(A)位点使用 YTHDC1敲低导致LENG8颗粒溶解及3′UTR延长 siRNA转染后48–72小时收集细胞进行IP、IF或RNA-seq
摘要
无膜细胞器（MLOs）参与多种细胞过程和多个层次的基因调控。可变多聚腺苷化（APA）是一种广泛存在的基因调控机制，可在转录本中产生不同的3′非翻译区（UTR）。然而，哺乳动物中是否存在特定MLO调控APA仍 largely 未知。在此，我们揭示了一个名为LENG8颗粒（G颗粒）的核体，其作为APA调控的活跃枢纽发挥作用。LENG8缺失在培养细胞和雄性生殖细胞中均诱导广泛的3′UTR延长。机制上，相分离驱动的LENG8颗粒形成促进LENG8-CPSF4相互作用，并促进随后切割和多聚腺苷化（CPA）复合物的组装，从而有利于靶转录本中近端poly(A)位点的使用。我们进一步阐明YTHDC1-m⁶A景观协调LENG8颗粒的形成/维持和靶标选择。此外，LENG8颗粒表现出空间定位并与核斑点发生功能串扰。值得注意的是，靶转录本的3′UTR长度以细胞类型和发育阶段依赖的方式与LENG8颗粒组装及特性相关。我们的研究确立LENG8作为mRNA 3′末端加工的关键调控因子，并证明LENG8颗粒调控哺乳动物APA，推进了对MLO介导的poly(A)位点选择的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物中是否存在特定无膜细胞器调控可变多聚腺苷化，其机制及其与核斑点的功能联系如何。
- 核心机制
- 相分离驱动的LENG8颗粒形成促进LENG8-CPSF4直接互作并竞争PABPN1，促进CPA复合物在近端poly(A)位点组装，该过程依赖YTHDC1-m⁶A景观进行颗粒形成/维持和靶标选择。
- 主要证据
- LENG8缺失在培养细胞和雄性生殖细胞中引起广泛3′UTR延长；体外相分离与回补实验显示LENG8Δ24-66突变体无法形成颗粒且不能恢复近端poly(A)位点使用；YTHDC1敲低导致颗粒溶解和3′UTR延长，LENG8与YTHDC1靶标高度重叠。
- 研究意义
- 确立LENG8为mRNA 3′末端加工的关键调控因子，证明LENG8颗粒调控哺乳动物APA，推进了对无膜细胞器介导的poly(A)位点选择的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LENG8颗粒的鉴定与相分离特性验证
验证LENG8是否形成具有液滴性质的核内颗粒
免疫荧光观察LENG8与核体标志物定位，FRAP检测动态性，1,6-HD和RNase A处理，体外重组蛋白液滴形成与融合实验
LENG8条件敲除小鼠表型与APA分析
研究LENG8在精子发生和雄性生育中的作用及对3′UTR长度的影响
构建Stra8-Cre介导的LENG8条件敲除小鼠，进行H&E、TUNEL、scRNA-seq和QuantSeq 3′mRNA-seq分析
LENG8颗粒作为APA调控活跃位点的验证
验证LENG8颗粒是APA加工的活跃场所
EU标记新生RNA，actD抑制转录，smFISH检测靶mRNA定位，MS2 tethering报告系统及LENG8Δ24-66回补实验
LENG8-CPSF4互作及CPA复合物组装机制
阐明LENG8颗粒促进CPA复合物组装的分子机制
Co-IP、体外pull-down、高分辨成像、PABPN1敲低与回补、ZF4结构域定位
YTHDC1-m⁶A依赖的靶标选择验证
验证YTHDC1-m⁶A对LENG8颗粒形成和靶标选择的调控
m⁶A基序分析、m⁶A-seq、YTHDC1敲低与过表达、CLIP-seq/RIP-seq整合分析、4sU标记QuantSeq
LENG8颗粒在精子发生中的阶段依赖性分析
研究LENG8颗粒在不同生殖细胞阶段的定位与APA调控关系
比较精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞的3′UTR长度，免疫荧光观察LENG8与CPSF4、FIP1L1、YTHDC1、PABPN1共定位，核糖体 profiling
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达与互作
验证相分离与颗粒特性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | C11995500BT |
| RPMI1640培养基 | Gibco | C22400500CP | |
| 胎牛血清 | TransGen Biotech | FS201-01 | |
| 胎牛血清 | Vazyme Biotech Co.,Ltd | F103 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 质粒构建 | pCMV-Myc载体 | Clontech | 631604 |
| p3×Flag-CMV-10载体 | Sigma | E7658 | |
| pET-28a载体 | Novagen | 69864-3 | |
| pEGFP-C1载体 | Clontech | 6084-1 | |
| pEGFP-N2载体 | Clontech | 6081-1 | |
| pCOLD-GST载体 | Takara | 3372 | |
| ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | C112-01 | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | -- | -- |
| RNA提取 | RNAiso Plus RNA提取试剂 | Takara | -- |
| Western blot | Tanon-5200化学发光成像系统 | Tanon | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488驴抗小鼠二抗 | JACKSON ImmunoResearch | 715-545-150 |
| Alexa Fluor 594驴抗兔二抗 | JACKSON ImmunoResearch | 711-585-152 | |
| IFKine红色驴抗小鼠二抗 | Abbkine | A24411 | |
| IFKine绿色驴抗兔二抗 | Abbkine | A24221 | |
| ABflo 647偶联山羊抗小鼠IgG | ABclonal | AS059 | |
| Western blot/IF/IP | 抗LENG8抗体 | Signalway Antibody | 39875 |
| Western blot | 抗LENG8抗体 | Bethyl | A304-947A |
| Western blot/IF | 抗PABPN1抗体 | Beyotime Biotechnology | AG3616 |
| IF | 抗YTHDC1抗体 | Santa Cruz | sc-136428 |
| 抗CPSF4抗体 | Santa Cruz | sc-390643 | |
| 抗SYCP3抗体 | Santa Cruz | sc-74569 | |
| 抗NONO抗体 | Santa Cruz | sc-166702 | |
| 抗DDX25抗体 | Santa Cruz | sc-166289 | |
| Western blot | 抗CPSF4抗体 | Proteintech | 15023-1-AP |
| IF | 抗COIL抗体 | Proteintech | 67218-1-Ig |
| Western blot | 抗YTHDC1抗体 | ABclonal | A22992 |
| Western blot/IF | 抗FIP1L1抗体 | ABclonal | A7138 |
| Western blot | 抗GFP抗体 | Abways | AB0005 |
| 抗β-actin抗体 | Abways | Ab2001 | |
| 抗Myc抗体 | Abways | AB0001 | |
| 抗Flag抗体 | Abways | AB0008 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| IF | 抗SC35抗体 | Abcam | Ab11826 |
| Western blot/IF | 抗CPSF2抗体 | ABclonal | A9297 |
| IF | 抗CPSF6抗体 | Santa Cruz | sc-376228 |
| 抗SC35抗体 | Santa Cruz | sc-53518 | |
| 免疫沉淀 | 小鼠多克隆IgG | Merck | 12-371 |
| 兔多克隆IgG | Merck | 12-370 | |
| Western blot | HRP山羊抗小鼠IgG | Abbkine | A21010 |
| HRP山羊抗小鼠IgG LCS | Abbkine | A25012 | |
| HRP山羊抗兔IgG | Abbkine | A21020 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Yueke | -- |
| Ni-NTA琼脂糖珠 | Vazyme | -- | |
| 超滤离心管 | MERCK | -- | |
| 4sU标记 | 4-硫尿苷 | Sigma | -- |
| RNA纯化 | oligo(dT)磁珠 | NEB | S1419S |
| 4sU标记 | 二甲基亚砜 | Sigma | -- |
| QuantSeq文库构建 | QuantSeq 3′ mRNA-seq文库构建试剂盒 | Lexogen | -- |
| 质谱 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| UltiMate 3000纳升超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微成像 | Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| SpinSR10显微镜 | Olympus | -- | |
| OLYMPUS CKX53SF显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LENG8条件敲除小鼠构建与表型 | LENG8flox/ΔStra8-Cre基因型、敲除外显子3和4、睾丸重量统计n=12、TUNEL计数n=40曲细精管 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 3a–h图注 |
| 细胞培养与转染 | DMEM或RPMI1640培养基、10% FBS、siRNA浓度40–80 nM、转染后48–72 h收样 阅读提示：Methods中Mammalian cell culture及Transfection and RNAi小节 |
| 体外相分离实验 | 重组蛋白浓度1.2–12 μM、PEG6000浓度6%、NaCl浓度150–500 mM、1,6-HD 5% 阅读提示：Methods中Protein expression, purification, in vitro LLPS assay小节及Fig. 2g–i图注 |
| LENG8颗粒溶解处理 | RNase A 500 μg/ml处理20 min、1,6-HD 2%–10%处理10 min、actinomycin D 2 μM处理4 h 阅读提示：Methods中LENG8 granule dissolution小节及Fig. 4c图注 |
| QuantSeq 3′mRNA-seq与APA分析 | 细胞系阈值p<0.05且|ΔPDUI|>0.1，组织阈值p<0.05且|ΔPDUI|>0.2；PAS支持 reads>15且相对使用>10% 阅读提示：Methods中QuantSeq 3′ mRNA library and APA analysis小节及Fig. 3i、Fig. 4a图注 |
| YTHDC1敲低与过表达 | siYTHDC1序列、过表达质粒转染条件、4sU 100 μM处理2 h 阅读提示：Methods中Transfection and RNAi及4sU labeling SLAM-seq小节，Fig. 6图注 |
| MS2 tethering报告实验 | Chchd7 CDS和3′UTR插入6×MS2、MCP-LENG8或MCP-LENG8Δ24-66共转染、48 h后收样 阅读提示：Methods中Tethering reporter assay小节及Fig. 4f–h图注 |
| LENG8Δ24-66回补实验 | siLENG8转染后24 h转染野生型或突变质粒，72 h后收样 阅读提示：Methods中Transfection and RNAi小节及Fig. 4i图注 |