构建HCC免疫治疗单细胞图谱并评估临床疗效
建立整合队列与公共数据的单细胞图谱，依据临床疗效识别与免疫治疗相关的TIME组分。
对14例接受新辅助αPD-1治疗的HCC患者术后肿瘤样本进行scRNA-seq，整合5个公共数据集（60例）构建约46万细胞的图谱；依据RECIST v1.1和病理残留肿瘤比例将患者分为应答者（CPR/MPR）和非应答者（non-MPR）。
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整合单细胞多组学刻画揭示肝细胞癌新辅助免疫治疗中脂质相关巨噬细胞介导的免疫抑制
Integrated single-cell multi-omics characterization reveals lipid-associated macrophage-mediated immunosuppression in neoadjuvant immunotherapy of hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高含单细胞转录组、空间转录组、mIHC、流式、类器官及小鼠模型等多层级证据，并进行功能与机制验证
主要模型
14例接受新辅助αPD-1治疗的HCC患者肿瘤样本 60例公共HCC单细胞数据集 THP-1诱导的脂质相关巨噬细胞 患者来源HCC类器官（HCO） Hepa 1-6原位HCC小鼠模型
重点核对
14例HCC免疫治疗队列的临床疗效评估：基于RECIST v1.1和病理残留肿瘤比例（CPR/MPR/non-MPR） LAM鉴定标志物：C1QA、FABP1、APOA1及脂质代谢特征 THP-1诱导LAM：PMA 100 ng/ml、IL-4/IL-13各20 ng/ml、油酸250 μM处理24 h 小鼠模型分组：RD、HFD、HFD+番茄红素（10 mg/kg）、HFD+西格列他钠（10 mg/kg），每组5只 抗PD-1治疗：10 mg/kg腹腔注射，每2天一次共3次
摘要
肝细胞癌（HCC）是一种高发病率和高死亡率的癌症。尽管免疫检查点抑制剂（ICI）改善了HCC患者的生存结局，但有限的客观缓解率凸显了研究免疫治疗决定因素的紧迫性。在此，我们通过构建一个全面的多模态单细胞转录组图谱来探索HCC对新辅助αPD-1免疫治疗的耐药机制，该图谱由来自我们队列（ClinicalTrials.gov ID: NCT06571396）的14例接受αPD-1治疗的HCC患者和60例外部队列中具有异质性治疗背景的HCC病例组成。在我们队列临床结局的监督下，我们识别了肿瘤免疫微环境（TIME）中免疫治疗的正向和负向调节因子，尤其是非应答者中脂质代谢状态增加、以C1QA、FABP1和APOA1表达为特征的脂质相关巨噬细胞（LAM）。我们进一步展示了LAM的存在、外源性诱导物和免疫抑制功能，以及其脂质相关状态的调控策略，包括番茄红素和西格列他钠。此外，我们构建了应答者与非应答者之间免疫调节因子的相互作用网络，显示出具有干预靶点的不同配体-受体景观。我们揭示了包括免疫抑制性LAM在内的TIME组分影响免疫治疗结局，从而为探索HCC免疫治疗的免疫景观和治疗策略提供了证据和见解。ClinicalTrials.gov ID: NCT06571396
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HCC新辅助αPD-1免疫治疗中，肿瘤免疫微环境哪些组分影响临床应答，其机制和干预策略如何。
- 核心机制
- HCC_FA来源的脂质代谢信号（如APOA1/APOE–TREM2）诱导LAM脂质积累状态，LAM通过SPP1/FN1介导ECM重塑及MIF–CD44、LGALS9–CD44、TGFB–TGFBR、IL10–IL10R等途径抑制T细胞功能，导致免疫治疗耐药。
- 主要证据
- 单细胞转录组图谱、空间转录组、mIHC和流式验证LAM存在及与疗效负相关；THP-1诱导LAM体外实验显示其增强Huh-7侵袭并抑制T细胞IFN-γ产生；HCO共培养实验显示LAM预暴露T细胞杀伤能力下降；HFD小鼠模型显示LAM扩增、T细胞功能受损且αPD-1疗效降低，番茄红素和西格列他钠可部分恢复。
- 研究意义
- 揭示了TIME中免疫抑制性LAM影响HCC免疫治疗结局，为探索HCC免疫治疗免疫景观和代谢干预策略提供了证据和见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定HCC细胞功能亚型并关联免疫治疗疗效
分析HCC细胞亚型及其与免疫治疗应答的关系。
对14例患者HCC细胞进行InferCNV过滤恶性细胞，NMF分为四个亚型（HCC_MA、HCC_prol、HCC_FA、HCC_EMT），scMetabolism分析代谢特征，Spearman相关分析亚型比例与疗效，空间转录组验证。
分析T/NK细胞亚型与免疫治疗应答的关系
探究T细胞亚型、分化轨迹和功能状态与免疫治疗应答的关联。
对T/NK细胞降维聚类鉴定12个亚型，Monocle2和Monocle3拟时序分析CD8+和CD4+ T细胞分化轨迹，比较应答者与非应答者功能基因表达和通路富集。
鉴定髓系亚型及LAM与免疫治疗疗效的关联
分析髓系细胞特别是巨噬细胞亚型与免疫治疗应答的关系。
对髓系细胞降维聚类鉴定13个亚型（含6种巨噬细胞），Monocle2/3拟时序分析单核-巨噬细胞分化轨迹，比较LAM和MacroInflam在应答者与非应答者中的分布。
全局关联分析及LAM调控机制探索
整合临床疗效与单细胞转录组，识别关键调控因子及LAM的诱导和调控机制。
CellChat比较应答者与非应答者细胞通讯网络，Spearman相关分析细胞类型/亚型比例与疗效，mIHC验证；配体-受体分析HCC_FA与LAM互作，CellCall和SCENIC分析转录因子PPARD/PPARA/PPARG。
验证LAM存在、体外诱导及其免疫抑制功能
验证LAM在HCC中的存在，建立体外LAM模型并探究其功能。
分析外部scRNA-seq和空间转录组数据验证LAM存在，mIHC和流式验证；THP-1经PMA、IL-4/IL-13和油酸诱导为LAM，Transwell实验检测Huh-7侵袭，LAM与患者PBMC来源T细胞共培养检测IFN-γ，HCO共培养检测T细胞杀伤功能，番茄红素处理检测脂滴。
体内验证LAM介导的免疫抑制及代谢干预效果
在体内验证LAM对αPD-1疗效的影响及番茄红素和西格列他钠的干预效果。
C57BL/6J雄性小鼠喂养RD或HFD 12周，原位接种Hepa 1-6细胞建立HCC模型，分为RD、HFD、HFD+LYC、HFD+CHI四组，抗PD-1治疗，检测肿瘤负荷、脂滴、LAM比例、T细胞功能和PPAR通路表达。
构建应答者与非应答者免疫互作网络
整合细胞通讯网络，揭示应答差异相关的配体-受体景观和干预靶点。
分别构建应答者和非应答者的CellChat互作网络，分析关键信号通路（APOA、SPP1、TNF、IFN-II等）和配体-受体互作，归纳免疫激活、趋化因子、白细胞介素、MHC相关、免疫抑制、ECM重塑和代谢调控七类功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞与空间转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium系统 | 10x Genomics | -- |
| Illumina HiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 空间转录组测序 | DynaSpatial FFPE空间基因表达试剂盒 | Dynamic Biosystems | -- |
| Illumina NovaSeq X Plus测序仪 | Illumina | -- | |
| 空间转录组文库质检 | Qubit 4.0 dsDNA HS检测试剂盒 | Thermo | Q32854 |
| Agilent 4150高灵敏度D5000 TapeStation | Agilent | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 佛波酯 | -- | -- | |
| 白细胞介素-4 | -- | -- | |
| 白细胞介素-13 | -- | -- | |
| 油酸 | -- | -- | |
| 番茄红素 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Fc受体阻断剂 | BioLegend | -- |
| 胞内固定缓冲液 | eBioscience | -- | |
| 透化缓冲液 | Beyotime | -- | |
| 莫能菌素 | eBioscience | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 类器官培养 | 低生长因子Matrigel | BD Biosciences | -- |
| 肝癌类器官培养基 | -- | -- | |
| 细胞迁移侵袭实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 组织消化 | I型胶原酶 | -- | -- |
| IV型胶原酶 | -- | -- | |
| DNase I | -- | -- | |
| 密度梯度离心 | 淋巴细胞分离液 | -- | -- |
| T细胞分选与培养 | ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基 | -- | -- |
| 动物实验 | 西格列他钠 | Chipscreen Biosciences Ltd. | -- |
| 抗PD-1单克隆抗体 | -- | -- | |
| 蛋白提取与检测 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Western blot | 增强化学发光底物 | Vazyme | -- |
| UVP化学发光成像系统 | Upland | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Yeasen | -- |
| HiScript qRT-PCR SuperMix | Vazyme | -- | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | -- | |
| ABI 7500实时PCR系统 | ABI | -- | |
| 细胞活力检测 | 台盼蓝 | -- | -- |
| Countess II自动细胞计数仪 | -- | -- | |
| 细胞培养 | Hepa 1-6细胞 | Pricella | -- |
| THP-1细胞 | Pricella | -- | |
| Huh-7细胞 | Pricella | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HCC免疫治疗队列与疗效评估 | 患者纳入标准（病理确诊HCC、Child-Pugh A、ECOG 0–1、至少1周期PD-1为基础治疗）；疗效分级阈值（CPR 0%、MPR <50%、non-MPR ≥50%残留肿瘤） 阅读提示：Methods“Study design and sample selection”和“Inclusion and exclusion criteria”；Fig. 1e及Supplementary Table 1 |
| 单细胞转录组测序与质控 | 细胞活力>85%、上样浓度700–1200 cells/μl、基因数200–6000、线粒体reads<30%、DoubletFinder去除top 1% pANN 阅读提示：Methods“Single cell sample collection and suspension preparation”和“Raw sequencing data processing and quality control”；Supplementary Table 14 |
| THP-1诱导LAM及体外功能实验 | PMA 100 ng/ml 24 h；IL-4/IL-13各20 ng/ml 72 h；油酸250 μM 24 h；番茄红素50 μM 24 h；LAM:T细胞比例2:1共培养12 h；HCO:T效靶比3:1共培养48 h 阅读提示：Methods“Cell culture of THP-1 and lipid-associated macrophage staining”和“Co-culture assay for T cells-macrophages and T cells-HCOs”；Fig. 6e、6i |
| 小鼠原位HCC模型与药物干预 | C57BL/6J雄性小鼠18周龄；HFD 45%脂肪12周；Hepa 1-6 7×10^5细胞原位接种；抗PD-1 10 mg/kg每2天一次共3次；番茄红素/西格列他钠10 mg/kg每天一次共7次；每组5只；第14天取材 阅读提示：Methods“Mouse models and treatments”；Fig. 7a |
| 流式细胞术检测T细胞功能 | LAM比例设门：CD45+ F4/80+ CD11b+ C1Q+；T细胞功能指标：IFN-γ、TNF、Ki-67、PD-1、TIGIT、FOXP3；刺激4 h含monensin 阅读提示：Methods“Isolation of immune cell and flow cytometry”；Fig. 7e、7f及Supplementary Fig. 7 |