建立肌酸补充小鼠模型并评估肿瘤转移
验证外源性肌酸是否促进肿瘤转移
小鼠口服肌酸或食用肌酸饮食7天后尾静脉注射肿瘤细胞，检测肺转移灶、CTC清除和生存期
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外源性肌酸补充通过巨核细胞肌酸激酶B-STAT5B信号促进肿瘤转移
Exogenous creatine supplementation promotes tumor metastasis via megakaryocyte creatine kinase B-STAT5B signaling.
实验完整度
高包含多种小鼠肿瘤转移模型、巨核细胞特异性基因敲除小鼠、体外细胞实验、磷酸化蛋白质组学及人体志愿者研究，并有功能与机制验证
主要模型
B16-F10-GFP黑色素瘤小鼠尾静脉注射转移模型 Pf4 Cre; Slc6a8flox/flox巨核细胞特异性敲除小鼠 Pf4 iCre; Stat5bflox/flox巨核细胞特异性敲除小鼠 健康志愿者血小板过继转移至免疫缺陷小鼠模型
重点核对
野生型或Pf4 Cre; Slc6a8flox/flox小鼠给予肌酸7天，检测巨核细胞内肌酸浓度 野生型或Pf4 iCre; Stat5bflox/flox小鼠给予肌酸7天，检测巨核细胞基因表达与血小板功能 STAT5-IN-1以5 mg/kg每日口服给药，检测血小板功能基因表达与过继转移后肺转移 健康志愿者每日口服20 g肌酸14天，检测血小板聚集与CD41+细胞基因表达 过继转移模型中每只小鼠静脉注射1×10^5肿瘤细胞与1×10^9血小板
摘要
肌酸补充剂广泛用于体育运动，在运动人群中日益流行。尽管肌酸的生理作用已被广泛研究，但病理条件下的肌酸生物学仍知之甚少。本文报道，外源性肌酸补充通过血小板激活机制在多种小鼠模型和人类中促进肿瘤转移。机制上，肌酸补充增加巨核细胞肌酸水平并上调肌酸激酶B（CKB）。无偏磷酸化蛋白质组学揭示，CKB下游的非经典STAT5B磷酸化启动多种血小板功能基因，导致功能亢进、促进转移的血小板。巨核细胞特异性敲除肌酸转运体Slc6a8或Stat5b，以及药理学抑制STAT5，可消除肌酸增强的血小板功能亢进并预防小鼠中的转移。重要的是，健康志愿者补充肌酸导致外周血小板功能亢进，增加转移风险。总之，我们的研究揭示了肌酸诱导转移的机制见解，并提供了一种通过靶向巨核细胞肌酸代谢的抗转移治疗范式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 外源性肌酸补充是否通过宿主细胞（尤其是巨核细胞和血小板）影响肿瘤转移，及其机制为何。
- 核心机制
- 肌酸经巨核细胞SLC6A8摄取后上调CKB，CKB在非经典位点S127磷酸化STAT5B，促进其核转位并启动血小板功能基因转录，产生功能亢进血小板。
- 主要证据
- 多种小鼠肿瘤转移模型显示肌酸促进肺转移；巨核细胞特异性Slc6a8或Stat5b敲除及STAT5抑制剂消除肌酸诱导的血小板功能亢进和转移；磷酸化蛋白质组学、体外激酶实验和ChIP验证CKB-STAT5B轴；健康志愿者补充肌酸后血小板功能亢进并在过继转移模型中促进转移。
- 研究意义
- 揭示外源性肌酸通过巨核细胞肌酸代谢促进肿瘤转移的机制，提出靶向巨核细胞肌酸代谢的抗转移治疗范式。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证血小板在肌酸促转移中的作用
确定肌酸是否通过血小板促进转移
从肌酸处理小鼠分离血小板，与肿瘤细胞共注射至受体小鼠，检测肺转移和生存期；使用阿司匹林抑制血小板活化
检测肌酸对血小板功能及巨核细胞基因表达的影响
明确肌酸是否诱导血小板功能亢进及其来源
检测血小板聚集、颗粒数、凝血弹性图，分离巨核细胞检测血小板受体和颗粒相关基因表达；体外用肌酸处理巨核细胞和血小板
巨核细胞特异性Slc6a8敲除验证转运体作用
验证巨核细胞肌酸转运体SLC6A8在肌酸诱导血小板功能亢进和转移中的作用
构建Pf4 Cre; Slc6a8flox/flox小鼠，给予肌酸后检测巨核细胞内肌酸、血小板聚集、基因表达及过继转移后肺转移
验证CKB在肌酸诱导巨核细胞基因表达中的作用
确定CKB是否介导肌酸诱导的血小板功能基因表达
检测肌酸处理巨核细胞中CKB和磷酸肌酸水平；使用Ckb siRNA和过表达载体在体外巨核细胞中验证
磷酸化蛋白质组学与CKB-STAT5B机制验证
鉴定CKB下游磷酸化转录因子及非经典STAT5B磷酸化位点
对肌酸处理巨核细胞进行磷酸化蛋白质组学；构建STAT5B突变体，进行体外激酶实验、免疫沉淀、核转位检测和ChIP
药理学抑制STAT5及巨核细胞特异性Stat5b敲除验证
验证STAT5B在肌酸诱导血小板功能亢进和转移中的作用及治疗潜力
使用STAT5-IN-1体内给药，检测巨核细胞基因表达和过继转移后肺转移；构建Pf4 iCre; Stat5bflox/flox小鼠验证
健康志愿者肌酸补充及人血小板过继转移
将小鼠发现转化至人类，验证肌酸补充是否诱导人血小板功能亢进并促进转移
11名健康志愿者每日口服20 g肌酸14天，检测血小板聚集、CD41+细胞基因表达；将人血小板与小鼠肿瘤细胞共注射至免疫缺陷小鼠
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | YEASEN | 40130ES76 |
| 胎牛血清 | Meilunbio | MA0212-1 | |
| 青霉素-链霉素 | Meilunbio | MA0110 | |
| RPMI 1640培养基 | Meilunbio | MA0215 | |
| 巨核细胞分离 | 小鼠巨核细胞分离试剂盒 | TBD Science | MAG2014M |
| 人CD41+细胞分离 | 抗Alexa Fluor 647磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-395 |
| 兔抗人CD41/ITGA2B抗体 | Abclonal | A11836 | |
| Alexa Fluor 647标记驴抗兔抗体 | Invitrogen | A31573 | |
| 肌酸补充 | 肌酸单水合物 | Yuanye | S20197 |
| 肌酸饮食 | 5% w/w肌酸单水合物补充饲料 | Ready Dietech | RC10120 |
| 对照饮食 | 常规对照饲料 | Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering | XT01WC-009 |
| 血小板活化抑制 | 阿司匹林 | Meilunbio | MB1790 |
| STAT5抑制 | STAT5抑制剂STAT5-IN-1 | MedMol | S84762 |
| 二甲基亚砜 | Meilunbio | PWL064 | |
| 体外巨核细胞处理 | 肌酸 | -- | -- |
| Jurkat细胞STAT5激活 | 白介素-2 | MCE | HY-P7037B |
| 脂质体制备 | 氢化大豆磷脂 | AVT | N01003 |
| 胆固醇 | AVT | O01001 | |
| DSPE-PEG 2000 | AVT | F01008 | |
| shRNA敲低 | Slc6a8 shRNA | Genomeditech | 103815, 103816, 103818 |
| 对照shRNA | Genomeditech | 2519 | |
| siRNA敲低 | Gatm siRNA | RIBBIO | siB13424174921, siB13424174934, siB13424174947 |
| Ckb siRNA | RIBBIO | siG171113021556, siG171113021601, siG171113021607 | |
| 对照siRNA | RIBBIO | siN0000001-1-5 | |
| siRNA转染 | 脂质体转染试剂 | YEASEN | 40802ES03 |
| 质粒转染 | GMTrans脂质体转染试剂 | Genomeditech | TG-10015-2 |
| 免疫印迹 | SmartPAGE预制蛋白胶 | Smart-Lifesciences | SLE015 |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 兔抗GP6抗体 | Abcam | ab302950 | |
| 兔抗P2RY12抗体 | Proteintech | 11976-1-AP | |
| 兔抗SLC6A8抗体 | Proteintech | 20299-1-AP | |
| 小鼠抗CKB抗体 | Proteintech | 66764-1-Ig | |
| 兔抗STAT5B抗体 | Cell Signaling Technology | 34662 | |
| 兔抗磷酸化STAT5抗体 | ABclonal | AP0138 | |
| 小鼠抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 免疫沉淀 | 抗DYKDDDDK（FLAG）磁珠 | Smart-Lifesciences | SM009001 |
| DynaMag-2磁力架 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| 小鼠抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 兔抗磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸抗体 | Thermo Fisher Scientific | 61-8300 | |
| 核质分离 | NE-PER核质分离试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 |
| 染色质免疫沉淀 | ChIP实验试剂盒 | Beyotime | p2078 |
| 兔对照IgG抗体 | ABclonal | AC005 | |
| RNA提取 | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP419 |
| 逆转录 | Hifair II第一链cDNA合成预混液 | YEASEN | 11123ES60 |
| qPCR | Hieff qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | 11203ES03 |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | 鸡抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗鸡IgY二抗 | Abcam | ab150169 | |
| DAPI | Solarbio | C0060 | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| Hoechst 33342 | Solarbio | IH0070 | |
| FACS canto II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 体外激酶实验 | His-CKB重组蛋白 | MCE | HY-P7897 |
| 激酶缓冲液 | MesGen | MKB1235 | |
| 磷酸化蛋白质组学 | High-Select Fe-NTA磷酸肽富集试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A32992 |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| nanoElute 2高性能纳升液相色谱系统 | Bruker | -- | |
| timsTOF Pro2质谱系统 | Bruker | -- | |
| 肌酸检测 | 肌酸检测试剂盒 | Abcam | ab65339 |
| Synergy 2多功能酶标仪 | BioTek | -- | |
| 磷酸肌酸检测 | 磷酸肌酸ELISA试剂盒 | Cloud-clone | USCN-CEV808Ge |
| 血小板-肿瘤细胞黏附实验 | PKH26荧光染料 | MCE | HY-D1451 |
| X-LIGHT V2转盘共聚焦显微镜 | 89 North | -- | |
| 血小板聚集试验 | ADP | Meilunbio | MB1706 |
| 凝血酶 | Chrono-Log | P/N 386 | |
| 胶原 | Chrono-Log | P/N 385 | |
| 血小板聚集仪 | Helena | Aggram | |
| 人血小板聚集试验 | 血小板聚集试剂（ADP） | Sinnowa | 23811000 |
| 花生四烯酸 | Sinnowa | 23812010 | |
| 血小板聚集试剂（胶原） | Sinnowa | 23802100 | |
| 人血小板功能分析 | Aggrestar血小板功能分析仪 | Sinnowa | PL-12 |
| 血栓弹力图 | 血栓弹力图仪 | Haemonetics Corporation | TEG@5000 |
| 透射电子显微镜 | Ultracut E超薄切片机 | Leica | -- |
| Tecnai G2 Spirit电子显微镜 | FEI | -- | |
| 全血细胞计数 | 全自动血液分析仪 | Mindary | BC-2600 |
| 人全血细胞计数 | 全自动血液分析仪 | Mindary | BC-6800 PLUS |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肌酸补充小鼠模型 | 肌酸剂量42.5 mg/mL、每只400 μL、每周三次口服；或5% w/w肌酸饮食；给药时长7天；小鼠品系C57BL/6J雄性6-8周或BALB/cJ雌性 阅读提示：Methods中Diet and drug treatment及Animals小节；Fig. 1图注 |
| 尾静脉注射肿瘤转移模型 | 每只小鼠静脉注射1×10^5肿瘤细胞与1×10^9血小板（过继转移模型）；注射后14天（MC38为21天）取材；B16-F10-GFP、MC38、LLC、4T1细胞系来源 阅读提示：Methods中Infused tumor cell metastasis model and adoptive platelet transfer model小节；Fig. 1、Fig. 3图注 |
| 巨核细胞特异性基因敲除小鼠 | Pf4 Cre与Slc6a8flox/flox杂交；Pf4-P2A-iCre与Stat5bflox/flox杂交；基因型鉴定引物序列；敲除效率验证 阅读提示：Methods中Animals小节；Fig. 3a、Fig. 6c图注；Supplementary Fig. 4a、Fig. 6d |
| STAT5抑制剂体内给药 | STAT5-IN-1剂量5 mg/kg每日口服；DMSO对照；给药时长文中未明确说明（推测与肌酸7天同步，但原文未明确说明） 阅读提示：Methods中Diet and drug treatment小节；Fig. 6a、b图注 |
| 血小板聚集试验 | ADP 10 μM、胶原0.8 μg/mL、凝血酶0.025 U/L；最大聚集率在刺激后6分钟评估；小鼠或人血小板来源 阅读提示：Methods中Platelet aggregometry and thromboelastography小节；Fig. 2b、Fig. 7c图注 |
| 健康志愿者肌酸补充 | 11名健康志愿者（6男5女，20-25岁，BMI 20.94±3.59 kg/m2）；每日20 g肌酸单水合物粉末，14天；第0、3、7、14天采血 阅读提示：Methods中Human studies小节；Fig. 7a、b图注 |
| 磷酸化蛋白质组学 | 肌酸处理巨核细胞n=3 mice per group；差异磷酸化肽筛选标准fold change ≥1.2或≤0.83且P<0.05；质谱平台timsTOF Pro2 阅读提示：Methods中Phosphoproteomics小节；Fig. 5a图注 |
| 体外激酶实验 | His-CKB 0.4 μg/μL与FLAG-STAT5B 1 μg/μL；0.5 μM ATP；激酶缓冲液组成；室温1小时 阅读提示：Methods中In vitro kinase assay小节；Supplementary Fig. 6c、d |