ITP骨髓单细胞与空间转录组分析
鉴定ITP骨髓中中性粒细胞与巨核细胞的转录组改变及空间邻近关系。
对ITP患者和健康对照骨髓进行scRNA-seq，分析细胞组成、S100A8/S100A9和GATA1表达、配体–受体互作及KEGG通路；并分析公共Visium空间转录组切片中中性粒细胞、巨核细胞和S100A8/A9模块的空间邻近性。
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中性粒细胞来源的S100A8/A9损害免疫性血小板减少症中的巨核细胞成熟
Neutrophil-derived S100A8/A9 impairs megakaryocyte maturation in immune thrombocytopenia.
实验完整度
高含患者骨髓scRNA-seq、空间转录组、原代CD34+巨核细胞功能与机制验证、Cut&Tag/ChIP及主动和被动ITP小鼠模型体内药效验证。
主要模型
ITP患者骨髓与外周血样本 健康供者CD34+来源原代巨核细胞培养 Meg-01人巨核细胞系 主动与被动ITP小鼠模型
重点核对
原代CD34+巨核细胞培养中ITP血浆（10例供者混合）与健康血浆（10例供者混合）的1%（v/v）处理及tasquinimod 2 μM、IAXO-102 10 μM干预 重组人S100A8/A9 0–3 μg/mL处理及S100A8/A9免疫清除ITP血浆的效应 主动ITP模型：Itgb3a−/−供者脾细胞转移至照射RAG1−/−受体，tasquinimod 1 mg/kg腹腔注射 被动ITP模型：抗小鼠CD42b抗体0.1 μg/g于第0、1天静脉注射，tasquinimod 1 mg/kg腹腔注射 c-Jun对GATA1启动子的结合与位点选择性占位（Cut&Tag、ChIP–qPCR、荧光素酶报告）
摘要
免疫性血小板减少症（ITP）的特征是自身抗体介导的血小板清除，但炎症介质如何损害血小板生成仍不明确。利用单细胞和空间转录组学，我们在ITP骨髓中鉴定出一条中性粒细胞–巨核细胞轴，其中中性粒细胞来源的S100A8/A9结合TLR4并激活JNK/c-Jun信号。该通路抑制巨核细胞主调控因子GATA1并限制其成熟。在原代CD34+来源的巨核细胞培养中，ITP血浆降低多倍体化、成熟标志物表达和血小板样颗粒释放；tasquinimod处理或TLR4抑制部分恢复这些终点。在主动和被动ITP小鼠模型中，tasquinimod改善血小板恢复、使骨髓巨核细胞丰度正常化并减弱MAPK特征。总之，这些互补数据将中性粒细胞定位为ITP中血小板生成失败的贡献者，将骨髓炎症与血小板生成缺陷联系起来，并将S100A8/A9–TLR4–JNK/c-Jun轴提名为治疗靶点。调节该通路可部分恢复巨核细胞生成并在体内缓解血小板减少，支持将S100A8/A9–TLR4信号的药理学靶向作为ITP治疗的潜在辅助手段。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ITP骨髓炎症如何损害巨核细胞成熟和血小板生成，中性粒细胞来源的S100A8/A9是否以及如何直接破坏这一过程？
- 核心机制
- 中性粒细胞来源的S100A8/A9结合巨核细胞TLR4，激活JNK/c-Jun信号，c-Jun在GATA1调控区特定位点占位并抑制GATA1表达，从而限制巨核细胞成熟和血小板生成。
- 主要证据
- ITP患者骨髓scRNA-seq和空间转录组显示中性粒细胞–巨核细胞共定位及S100A8/A9升高；原代CD34+巨核细胞中ITP血浆降低多倍体化、CD41/CD42b/CD61表达和PLP释放，tasquinimod、TLR4抑制或S100A8/A9免疫清除部分恢复；Cut&Tag、ChIP–qPCR和荧光素酶实验显示c-Jun抑制GATA1；主动和被动ITP小鼠中tasquinimod改善血小板恢复和骨髓巨核细胞数量。
- 研究意义
- 将骨髓中性粒细胞–巨核细胞轴与ITP血小板生成失败联系起来，并提出S100A8/A9–TLR4–JNK/c-Jun轴作为潜在治疗靶点，可能作为针对外周血小板清除疗法的辅助策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外周血和骨髓样本验证S100A8/A9升高
验证S100A8/A9在ITP中的表达升高及其与血小板计数的关系。
检测外周血S100A8、S100A9 mRNA和血浆S100A8/A9蛋白，检测骨髓穿刺液上清S100A8/A9，并重分析公共PBMC转录组队列。
原代CD34+来源巨核细胞功能验证
确定ITP血浆是否通过S100A8/A9–TLR4损害巨核细胞成熟和功能。
将健康供者CD34+细胞向巨核细胞分化，第4天加入混合健康或ITP血浆，并以tasquinimod或IAXO-102干预；检测CD41/CD42b/CD61、多倍体、PLP释放、凋亡、黏附、迁移和超微结构。
单细胞转录组解析巨核细胞分化轨迹
评估ITP血浆是否改变巨核细胞亚群比例和分化轨迹，以及tasquinimod的逆转作用。
对体外培养巨核细胞进行scRNA-seq，注释亚群，进行RNA速度、拟时序和通路富集分析。
S100A8/A9–TLR4下游信号与GATA1调控机制验证
确定TLR4下游关键分支及c-Jun对GATA1的直接调控。
Western blot检测TLR4、p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun和GATA1；在Meg-01中进行c-Jun Cut&Tag、基序分析、荧光素酶报告和过表达/敲低；在原代巨核细胞中进行c-Jun ChIP–qPCR和TLR4/RAGE敲低。
主动ITP小鼠模型体内验证
评估tasquinimod对主动ITP模型中血小板恢复和巨核细胞的影响。
将Itgb3a−/−供者脾细胞转移至亚致死照射的RAG1−/−受体，给予tasquinimod，监测血小板计数、骨髓和脾脏巨核细胞、血浆S100A8/A9、出血时间及骨髓scRNA-seq。
被动ITP小鼠模型及中性粒细胞/S100A8/A9干预验证
在抗体介导的被动ITP中验证S100A8/A9–TLR4通路的作用及tasquinimod疗效。
野生型C57BL/6小鼠第0、1天静脉注射抗CD42b抗体，给予tasquinimod；另用重组S100A8/A9和抗Ly6G中性粒细胞清除验证中性粒细胞来源S100A8/A9的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 原代细胞培养 | 无血清扩增培养基 | STEMCELL Technologies | 09650 |
| 血小板生成素 | PeproTech | 300-18-10UG | |
| 干细胞因子 | PeproTech | 300-07-10UG | |
| 白细胞介素-3 | PeproTech | 200-03-10UG | |
| CD34+细胞富集 | EasySep人CD34阳性选择试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17897 |
| 药物处理 | 他喹莫德 | Selleckchem | S7617 |
| IAXO-102 | Selleckchem | S0002 | |
| 重组蛋白处理 | 重组人S100A8/A9 | R&D Systems | 8226-S8 |
| 重组小鼠S100A8/A9 | R&D Systems | 8916-S8 | |
| 流式分析 | 抗人CD41a（APC） | BioLegend | 984504 |
| 抗人CD42b（FITC） | BioLegend | 303903 | |
| 抗人CD61（PE） | BioLegend | 336405 | |
| 倍体分析 | 碘化丙啶 | Invitrogen | R37169 |
| 凋亡检测 | Annexin V–APC/PI试剂盒 | BioLegend | 640932 |
| 细胞黏附实验 | 纤连蛋白 | Sigma | F2006 |
| Transwell迁移实验 | 基质细胞衍生因子-1α | PeproTech | 300-28A-10UG |
| S100A8/A9免疫清除 | 抗人S100A8/S100A9异二聚体单克隆抗体 | R&D Systems | MAB45701 |
| 同型IgG–Protein A/G磁珠 | Thermo Pierce | 88802 | |
| ELISA | S100A8/A9 ELISA试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0730 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | CST | 5871 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | A55860 | |
| 抗TLR4抗体 | CST | 14358 | |
| 抗JNK抗体 | CST | 9252 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | CST | 9251 | |
| 抗c-Jun抗体 | CST | 9165 | |
| 抗磷酸化c-Jun抗体 | CST | 3270 | |
| 抗GATA1抗体 | CST | 3535 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | 4970 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| SYBR Green qPCR预混液 | Thermo Fisher | K0221 | |
| Cut&Tag | pA-Tn5转座酶 | EpiCypher | 15-1117 |
| ChIP–qPCR | SimpleChIP Plus超声染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | 56383 |
| 免疫荧光 | 抗CD41抗体 | Abcam | ab134131 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 中性粒细胞清除 | 抗Ly6G单克隆抗体（克隆1A8） | Bio X Cell | BE0075-1 |
| 血小板聚集实验 | 胶原 | -- | -- |
| 血块回缩实验 | 凝血酶 | Sigma | T1063 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代CD34+来源巨核细胞培养与ITP血浆处理 | CD34+细胞接种密度2×10^5 cells/mL；TPO 100 ng/mL、SCF 100 ng/mL、IL-3 10 ng/mL；血浆为10例供者混合，1%（v/v）或部分实验5%；tasquinimod 2 μM、IAXO-102 10 μM；处理时间点第4天或第7天 阅读提示：Methods“In vitro megakaryocyte culture from human CD34+ cells”及Fig. 2A图注 |
| 重组S100A8/A9与tasquinimod剂量效应 | 重组人S100A8/A9 0–3 μg/mL，p-JNK检测1小时、CD41检测72小时、倍体检测11天；tasquinimod 0–3 μM处理72小时 阅读提示：Methods“In vitro megakaryocyte culture from human CD34+ cells”及Supplementary Fig. 2H–L |
| 主动ITP小鼠模型与tasquinimod给药 | Itgb3a−/−供者经野生型血小板1.0–1.5×10^9/次免疫4–6周；受体RAG1−/−小鼠6–8周龄、亚致死照射200–400 cGy、转移5×10^6–1×10^7脾细胞；tasquinimod 1 mg/kg腹腔注射，每日或隔日3–7天 阅读提示：Methods“Active ITP model in mice”及Fig. 5A图注 |
| 被动ITP小鼠模型与tasquinimod给药 | 野生型C57BL/6小鼠6–8周龄；抗小鼠CD42b抗体0.1 μg/g第0、1天静脉注射；tasquinimod 1 mg/kg腹腔注射每日1次3–5天 阅读提示：Methods“Passive ITP model”及Supplementary Fig. 5B图注 |
| 中性粒细胞清除与重组S100A8/A9体内干预 | 抗Ly6G 200 μg/只第−1天及每3天腹腔注射；重组小鼠S100A8/A9 50 μg/只每日腹腔注射 阅读提示：Methods“Neutrophil depletion and recombinant S100A8/A9 administration in ITP mouse models”及Supplementary Fig. 5E、F |
| c-Jun对GATA1启动子的结合与调控验证 | Cut&Tag在Meg-01中进行；ChIP–qPCR在原代CD34+来源巨核细胞中进行，使用1%混合血浆和tasquinimod 2 μM；荧光素酶报告检测c-Jun过表达对GATA1启动子的影响 阅读提示：Methods“Cut&Tag for c-Jun binding analysis”和“Chromatin immunoprecipitation (ChIP)–qPCR”及Fig. 4、Supplementary Fig. 4Q、R |