PAWR对RNA病毒复制的抑制作用
验证PAWR是否影响VSV、BEFV和IAV H3N2复制。
在HeLa、HEK293、MDBK、A549细胞中过表达、敲低或敲除PAWR，感染VSV、BEFV或H3N2，检测病毒基因mRNA、蛋白和TCID50滴度。
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PAWR通过促进PIM2-XBP1s-RIG-I信号轴增强抗RNA病毒先天免疫
PAWR augments anti-RNA viral innate immunity by promoting the PIM2-XBP1s-RIG-I signaling axis.
实验完整度
高包含RNA-seq、报告基因、ChIP、Co-IP、多种细胞模型、原代巨噬细胞及Pawr-/-小鼠体内感染验证
主要模型
HeLa与HEK293细胞系 THP-1、A549与MDBK细胞系 Pawr+/+与Pawr-/-小鼠来源MEF、PM、BMDM Pawr-/-小鼠VSV感染模型
重点核对
VSV以MOI=1感染，BEFV以MOI=0.1感染，IAV H3N2以MOI=1感染 Pawr-/-小鼠经尾静脉注射VSV 1×10^8 PFU，观察14天体重与生存 ChIP验证XBP1s结合RIG-I启动子−1785至−1771和−2024至−2018区域 4μ8C与Ceapin-A7均以10μM处理，DMSO为溶剂对照 Arylquin 1体外1μM处理，小鼠50mg/kg每日给药5天
摘要
PRKC Apoptosis WT1 Regulator（PAWR）已被认为与肿瘤发生相关。然而，其在抗病毒先天免疫中的作用仍未被探索。在本研究中，我们证明PAWR通过转录因子X-box binding protein 1（XBP1）在转录水平上调RIG-I表达。在机制上，PAWR增强ATF6/IRE1-XBP1通路以上调剪接型XBP1（XBP1s），同时促进PIM2介导的XBP1s Ser68位点磷酸化。活化后的XBP1s结合RIG-I启动子，驱动RIG-I表达，并在RNA病毒感染期间放大IFN-I反应。最引人注目的是，PAWR沉默的THP-1细胞和原代巨噬细胞表现出减弱的抗RNA病毒IFN-I反应。Pawr缺陷小鼠对RNA病毒攻击更易感。值得注意的是，PAWR的小分子激活剂Arylquin 1以PAWR依赖的方式增强RIG-I介导的IFN-I反应，从而抑制VSV复制。总之，我们的发现突出了PAWR通过PIM2-XBP1s-RIG-I信号轴在抗病毒先天免疫中的关键功能，并确立其作为RNA病毒感染潜在治疗靶点的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAWR是否参与抗RNA病毒先天免疫，以及其调控RIG-I和IFN-I反应的机制是什么。
- 核心机制
- PAWR激活ATF6/IRE1-XBP1通路并促进PIM2介导的XBP1s Ser68磷酸化，活化XBP1s结合RIG-I启动子，转录上调RIG-I，放大IFN-I反应。
- 主要证据
- 在HeLa、HEK293、MDBK、A549、THP-1及小鼠原代MEF、PM、BMDM中，PAWR过表达/沉默/敲除改变VSV、BEFV、H3N2复制和IFN-I反应；荧光素酶、ChIP、Co-IP验证XBP1s结合与PIM2磷酸化；Pawr-/-小鼠VSV感染更严重。
- 研究意义
- 揭示PAWR在抗病毒防御中的作用，并将PAWR及其激活剂Arylquin 1提示为RNA病毒感染潜在治疗靶点和广谱抗病毒策略方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PAWR对IFN-I信号的增强作用
明确PAWR是否增强RNA病毒触发的I型干扰素反应。
在细胞系及Pawr+/+与Pawr-/-小鼠来源MEF、PM、BMDM中检测Ifnb和ISGs表达，并用poly(I:C)、LPS等刺激比较特异性。
PAWR上调RIG-I及IFN-I信号链路
确定PAWR作用于RIG-I介导的信号通路哪一环节。
用IFN-β启动子荧光素酶报告基因联合RIG-I-N、MAVS、TBK1、IRF3-5D，并检测RIG-I、p-TBK1、p-IRF3及RIG-I mRNA。
XBP1s介导RIG-I转录上调
确定PAWR上调RIG-I所依赖的转录因子及启动子区域。
构建RIG-I启动子截短与突变体进行荧光素酶分析，预测并验证XBP1s结合位点，采用ChIP和ChIP-qPCR及XBP1s敲低验证。
PAWR激活ATF6/IRE1-XBP1通路
阐明PAWR如何上调XBP1s表达。
检测UPR三条通路的ATF6N、p-IRE1、XBP1s和PERK通路蛋白，并用IRE1抑制剂4μ8C和ATF6抑制剂Ceapin-A7干预。
PIM2介导XBP1s Ser68磷酸化
确定PAWR促进XBP1s磷酸化的激酶及关键位点。
免疫沉淀检测XBP1s磷酸化，生信预测候选激酶，Co-IP验证PIM2-XBP1s互作，构建S68A突变体并检测RIG-I表达。
Pawr-/-小鼠体内验证
评估PAWR缺失对体内抗RNA病毒免疫的影响。
尾静脉注射VSV后监测体重和生存，检测肺、脾、肝的组织病理、IFN-I反应、病毒载量及RIG-I和通路蛋白。
Arylquin 1药理学验证
验证PAWR激活剂Arylquin 1的抗病毒作用及PAWR依赖性。
在HEK293、PM、BMDM及PAWR-KO细胞中检测Arylquin 1对VSV复制和IFN-I反应的影响，并在小鼠中评估生存与组织指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达与相互作用
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | VivaCell | C3110-0500 |
| 胎牛血清 | TransGen Biotech | FS301-02 | |
| 青霉素 | Procell | PB180120 | |
| 链霉素 | Procell | PB180120 | |
| RPMI-1640培养基 | KeyGEN BioTECH | KGL1501-500 | |
| BMDM分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | CJ46 |
| 病毒扩增 | TPCK处理胰蛋白酶 | -- | -- |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Foregene | RE-03111 |
| 逆转录cDNA合成预混试剂盒 | Accurate | AG11706 | |
| SYBR Green Pro Taq HS PCR预混液 | Accurate | AG11701 | |
| Light Cycler 480II系统 | Roche | -- | |
| 免疫共沉淀 | 免疫共沉淀裂解液 | Solarbio | R0030 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Solarbio | FJP0100 | |
| 蛋白A/G磁珠 | Biolinkedin | L-1004 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | NCM | WB3100 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | NCM | P001 | |
| ECL化学发光试剂 | SparkJade | ED0015 | |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 染色质免疫沉淀 | ChIP检测试剂盒 | Beyotime | P2078 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Yeasen | 40203ES |
| 组织病理 | H&E染色试剂盒 | Yeasen | 60524ES60 |
| Western blot | 抗RIG-I抗体 | Proteintech | 20566-1-AP |
| 抗XBP1s抗体 | Proteintech | 24868-1-AP | |
| 抗PAWR抗体 | Proteintech | 20688-1-AP | |
| 抗PAWR抗体 | Abclonal | A4983 | |
| 抗β-actin抗体 | Abclonal | AC038 | |
| 抗磷酸化IRE1-S724抗体 | Abclonal | AP1442 | |
| 抗磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体 | Abclonal | AP0893 | |
| 抗磷酸化PERK(T982)抗体 | Abclonal | AP1501 | |
| 抗HA标签（HRP偶联）抗体 | Abclonal | AE025 | |
| 染色质免疫沉淀 | 正常兔IgG（ChIP配方） | Cell Signaling Technology | 2729 |
| XBP-1s抗体 | Cell Signaling Technology | 40435 | |
| Western blot | 鼠抗MAVS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166583 |
| 鼠抗IRE1α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390960 | |
| 鼠抗ATF6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166659 | |
| 抗VSV G抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | AB0053 | |
| 抗Flag标签抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | AB0008 | |
| 抗RIG-I抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY6992 | |
| 抗TBK1抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5145 | |
| 抗IRF3抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5779 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY8364 | |
| 抗磷酸化IRF3(S386)抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY6575 | |
| 抗YY1抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5160 | |
| 抗PAX5抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5970 | |
| 抗IRF2抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5847 | |
| 抗RUNX2抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5864 | |
| 抗SUMO2/3抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | AY0575 | |
| 抗XBP1u抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY6725 | |
| 抗eIF2A抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | AB3335 | |
| 抗磷酸化eIF2A(S51)抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5036 | |
| 抗PERK抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | AY2021 | |
| 抗ATF4抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5873 | |
| 抗PIM2抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY8633 | |
| 抗P38抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5262 | |
| 抗磷酸化P38抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY6390 | |
| 抗c-JUN抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5290 | |
| 抗磷酸化c-JUN抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5881 | |
| 抗ERK抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5100 | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5277 | |
| 抗JNK1/2/3抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5490 | |
| 抗磷酸化JNK1/2/3抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY5541 | |
| 抗TAK1抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY7057 | |
| 抗磷酸化TAK1抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY9059 | |
| 抗GSK3β抗体 | Abways Biotechnology Co., Ltd. | CY2434 | |
| 过氧化物酶AffiniPure山羊抗兔抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 111-035-144 | |
| 过氧化物酶AffiniPure山羊抗小鼠抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| 流式分析 | CD3ε抗体 | BD Biosciences | 552774 |
| CD8a抗体 | BD Biosciences | 563068 | |
| NK-1.1抗体 | BD Biosciences | 562921 | |
| CD4抗体 | eBioscience | E-AB-F1097J |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒复制检测 | 病毒种类、MOI、感染时间：VSV MOI=1、BEFV MOI=0.1、IAV H3N2 MOI=1，感染12或24 h采样；TCID50计算方法 阅读提示：Methods中Virus challenge and TCID50 assay及Fig.1图注、Supplementary Fig.1 |
| PAWR过表达/敲低/敲除 | 转染后时间24 h；PAWR-KO HEK293以puromycin 1μg/mL筛选至少7天；HeLa以2μg/mL、MDBK以4μg/mL筛选稳定敲低株 阅读提示：Methods中CRISPR/Cas9-mediated gene knockout and shRNA/siRNA-based gene knockdown |
| IFN-I反应检测 | poly(I:C) 2μg/mL转染8 h；VSV/BEFV感染12 h；检测IFNB及ISG15、ISG54、ISG56 mRNA 阅读提示：Fig.2与Supplementary Fig.2图注、Methods中RT-qPCR分析 |
| XBP1s结合RIG-I启动子 | ChIP使用抗XBP1s抗体，正常兔IgG阴性对照；目标区域−1785至−1771和−2024至−2018；VSV MOI=1感染12 h 阅读提示：Fig.4I、4J图注及Methods中ChIP assay |
| UPR通路抑制 | 4μ8C与Ceapin-A7浓度均为10μM，DMSO为溶剂对照，VSV MOI=1感染12 h 阅读提示：Fig.5C–E图注 |
| PIM2-XBP1s磷酸化 | XBP1s免疫沉淀检测磷酸化；PIM2敲低；S68A突变；MG132处理验证PIM2降解 阅读提示：Fig.6A–G及Supplementary Fig.8 |
| 小鼠体内感染 | 8-10周龄Pawr+/+与Pawr-/-小鼠，VSV 1×10^8 PFU尾静脉注射，观察14天（每组n=8）；组织检测72 h（每组n=6） 阅读提示：Fig.7图注、Supplementary Fig.9及Methods中Animal experiments |
| Arylquin 1处理 | 体外1μM处理12 h；小鼠50mg/kg每日给药5天；VSV 2×10^8 PFU静脉注射；CC50为1.987μM、IC50为0.1748μM 阅读提示：Fig.8、Supplementary Fig.10图注及Methods中Cell viability and antiviral activity test of Arylquin 1 |