建立谱系追踪膀胱癌细胞系
构建能够记录谱系信息并监测肿瘤生长的细胞模型。
将MGH-U3和RT4细胞系工程化，导入荧光素酶、Cas9-mCherry、目标位点、随机条形码和三重sgRNA，构建MGH-U3-LT和RT4-LT细胞系。
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膀胱癌化疗方案中的复发源于静息状态的表皮样细胞
Recurrence in the chemotherapy regimen of bladder carcinoma originates from quiescent epidermoid-like cells.
实验完整度
高整合体外细胞系、小鼠原位移植瘤模型、基因工程小鼠模型、患者配对样本及多组学分析，含功能与机制验证。
主要模型
MGH-U3-LT和RT4-LT人膀胱癌细胞系原位移植瘤模型 Trp53flox/flox; Ptenflox/flox; Akaluc-IRES-tdTomato基因工程小鼠膀胱癌模型 患者化疗前后配对肿瘤样本 肿瘤类器官模型
重点核对
MGH-U3-LT小鼠模型分组：Vehicle组n=6，Gemcitabine组n=20，每周一次共四周期 RT4-LT小鼠模型分组：Vehicle组n=6，Gemcitabine组n=20，每周一次共四周期 吉西他滨盐酸盐剂量240 mg/kg，膀胱内灌注，每周一次 CRISPR/Cas9敲除IGFBP5后MP-MGH-U3-LT细胞原位移植，每组n=6小鼠 患者样本：5对化疗前后配对肿瘤，3对免疫治疗前后配对肿瘤，8对原发NMIBC与复发MIBC配对肿瘤
摘要
癌症化疗后的复发仍然是癌症治疗中的主要挑战。通过在小鼠中整合高分辨率基于CRISPR/Cas9的演化谱系追踪与单细胞RNA测序，我们追踪了膀胱癌在存在或不存在化疗情况下的演化。我们发现，一个表现出表皮样细胞状态的细胞群体能够在化疗中存活。这些表皮样细胞离开静息状态以启动复发，通过涉及特定转录变化的不同演化路径产生组织学上不同的肿瘤。表皮样细胞的可塑性及演化过程中可塑性模式的改变塑造了复发肿瘤的表型。综合分析揭示，胰岛素样生长因子结合蛋白5是膀胱癌侵袭性进展和鳞状特征的关键共调控因子。阻碍胰岛素样生长因子结合蛋白5的表达可抑制复发肿瘤的化疗耐药和恶性行为。我们的研究阐明了膀胱癌自然进展和复发过程中的关键事件和演化动力学。它提供了一种可行的治疗途径，以克服复发性膀胱癌对传统化疗的难治性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 膀胱癌在化疗压力下如何存活并复发，其细胞起源和演化动力学是什么？
- 核心机制
- 化疗后存活的表皮样细胞（ELCs）离开静息状态启动复发，通过不同演化路径（涉及可塑性变化和特定转录改变）产生不同表型的复发肿瘤；IGFBP5是侵袭性进展和鳞状特征的共调控因子，其表观遗传调控参与化疗耐药和恶性行为。
- 主要证据
- 通过CRISPR/Cas9谱系追踪联合scRNA-seq在小鼠原位移植瘤和基因工程小鼠模型中追踪肿瘤演化，结合患者配对样本免疫组化验证SPRR3和IGFBP5表达，并通过IGFBP5敲除实验证实其抑制化疗耐药和恶性进展。
- 研究意义
- 阐明了膀胱癌自然进展和复发中的关键事件与演化动力学，提出靶向IGFBP5作为克服复发性膀胱癌化疗耐药和抑制侵袭性进展的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立原位移植瘤复发模型并给予化疗
模拟膀胱癌在化疗后的复发过程。
将工程化细胞注入免疫缺陷小鼠膀胱腔内，第3天开始每周一次膀胱内灌注吉西他滨或生理盐水，共四周期，之后停药观察肿瘤复发。
分析复发肿瘤表型和恶性程度
评估化疗后复发肿瘤的组织学表型和恶性潜能。
对复发肿瘤进行H&E染色、免疫组化、类器官培养和有限稀释原位移植实验。
单细胞转录组和谱系追踪分析
揭示复发肿瘤的转录组特征和演化路径。
对肿瘤进行scRNA-seq、scATAC-seq、全外显子测序和靶位点扩增子测序，结合谱系信息重构系统发育树并分析演化耦合和可塑性。
验证表皮样细胞和IGFBP5功能
验证表皮样细胞在化疗耐药中的作用及IGFBP5的功能。
通过SPRR3启动子-GFP报告系统、SPRR3过表达、IGFBP5敲除（CRISPR/Cas9）结合体内外实验验证其对化疗耐药和恶性进展的影响。
临床样本验证
在患者样本中验证SPRR3和IGFBP5的表达变化。
对化疗前后、免疫治疗前后及原发与复发配对患者肿瘤样本进行免疫组化和免疫荧光分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Gibco | 11320033 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5670201 | |
| 表皮生长因子 | MCE | HY-P7109 | |
| 胰岛素 | MCE | HY-P73243 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 链霉素/青霉素 | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 12633020 | |
| McCoy's 5A培养基 | Procell | PM150710 | |
| 药物处理 | 吉西他滨盐酸盐 | Sigma-Aldrich | 122111-03-9 |
| 动物实验 | 聚凝胺 | MedChemExpress | HY-112735 |
| 伊文思蓝染料 | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| 生物发光成像 | D-荧光素钠盐 | Genomeditech | GM-040611 |
| AkaLumine盐酸盐 | MedChemExpress | HY-112641A | |
| 免疫组化 | HE染色试剂盒 | Solarbio | G1120 |
| 两步法检测试剂盒 | ZSGB-Bio | PV-9000 | |
| 多重免疫组化 | 四色多重免疫组化试剂盒 | Panovue | 10001100020 |
| 组织解离 | I型胶原酶 | Solarbio | C8140 |
| IV型胶原酶 | Solarbio | C8160 | |
| DNase I | Solarbio | D8071 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3' V3.1试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0013 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Byeotime | P0012 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗IGFBP5抗体 | Proteintech | 55205-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | CST | #3700 | |
| SPRR3兔多克隆抗体 | HUABIO | ER1917-16 | |
| 山羊抗兔HRP | CST | #7074 | |
| 山羊抗鼠HRP | CST | #91196 | |
| 转染 | TransIntro® EL转染试剂 | TransGen Biotech | FT201 |
| 细胞筛选 | G-418硫酸盐 | MedChemExpress | 108321-42-2 |
| 靶位点扩增 | Kapa HiFi HotStart预混液 | Roche | KK2601 |
| DNA纯化 | DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411-03 |
| RNA提取和逆转录 | RNA提取和逆转录试剂盒 | Vazyme | RC112-01 and R323-01 |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| B27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | 98-92-0 | |
| A83-01 | MCE | HY-10432 | |
| Y-27632 | MCE | HY-10071 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| FGF10 | MCE | HY-P7342AF or HY-P7170 | |
| R-spondin-1 | MCE | HY-P72784 or HY-P76012 | |
| Noggin | MCE | HY-P70558 or HY-P70785 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A6013-10G | |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNA测序文库构建 | VAHTS Universal V6 RNA-seq文库构建试剂盒 | Vazyme | NR604-01 |
| DNA提取 | EasyPure®基因组DNA提取试剂盒 | TransGen | EE101-12 |
| 组织清洗 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-072 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原位移植瘤复发模型 | 细胞接种量1×10^5；吉西他滨剂量240 mg/kg；给药频率每周一次共四周期；小鼠品系NCG或BALB/c裸鼠 阅读提示：Methods中Tumour formation and grafting小节 |
| 基因工程小鼠模型 | AdenoKRT5-Cre病毒剂量25 μl混合；吉西他滨240 mg/kg在病毒注射后第七周开始，每周一次共四次 阅读提示：Methods中Tumour formation and grafting小节 |
| IGFBP5敲除体内实验 | 细胞接种量2×10^5；吉西他滨240 mg/kg每周一次共两周期；分组sgScr+vehicle、sgIGFBP5+vehicle、sgScr+chemo、sgIGFBP5+chemo 阅读提示：Methods中Tumour formation and grafting小节 |
| 有限稀释实验 | 细胞梯度2×10^4至2×10^6 cells/ml；注射体积50 µl；MGH-U3-LT和RT4-LT细胞1×10^3和1×10^4每组6只，1×10^5每组5只 阅读提示：Methods中Limiting dilution assay小节 |
| 患者样本分析 | 5对化疗前后配对样本；3对免疫治疗前后配对样本；8对原发NMIBC与复发MIBC配对样本 阅读提示：Methods中Human tumour samples小节及Figure 4、Figure 5图注 |