患者样本采集与多模态组学数据生成
获取NSCLC配对转移淋巴结和原发肿瘤的细胞及空间图谱。
采集19例NSCLC患者的转移淋巴结（n=22）、配对原发肿瘤（n=20）和癌旁正常肺（n=4）进行scRNA-seq；其中4例配对样本进行空间转录组测序；同时整合公共scRNA-seq和空间转录组数据。
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通过多模态组学解析非小细胞肺癌淋巴结转移的起源因素
Dissecting origin factors of lymph node metastasis in non-small cell lung cancer via multimodal omics.
实验完整度
高scRNA-seq与空间转录组患者样本，多数据集验证，体外敲低功能实验及小鼠尾静脉转移模型
主要模型
19例NSCLC患者配对转移淋巴结、原发肿瘤及癌旁正常肺组织 4例NSCLC患者配对转移淋巴结和原发肿瘤的空间转录组切片 A549和H460人肺癌细胞系 BALB/c裸鼠尾静脉注射肺转移模型
重点核对
敲低FTH1或IGHG4后检测EMT标志物（E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、MMP2/9、ZEB1/2、Twist）蛋白表达 FTH1或IGHG4敲低后Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力（n=3） FTH1敲低A549细胞（2×10^6/只）尾静脉注射裸鼠，10周后计数肺转移结节（n=6） 利用GSE127465、GSE123904和GSE131907等独立scRNA-seq数据集验证CSC、SPP1+IFI30+巨噬细胞和CXCL13+T细胞特征评分 TCGA-LUAD bulk RNA-seq聚类及生存分析验证CSC特征基因预后意义
摘要
癌症转移是大多数癌症相关死亡的原因，而淋巴结转移在癌症分期和预后中至关重要。然而，非小细胞肺癌（NSCLC）淋巴结转移的机制仍不清楚。在此，我们利用多模态组学描绘了NSCLC患者转移淋巴结及其配对原发肿瘤的细胞和空间图谱。结果显示，肿瘤核心区和外周区分别表现出高干性和免疫球蛋白表达升高。在免疫球蛋白高表达的恶性细胞和SPP1+IFI30+巨噬细胞中观察到CD274（PD-L1）表达增加。值得注意的是，鉴定出残留淋巴结构和三级淋巴结构。然而，它们的抗肿瘤免疫被CXCL13+ T细胞耗竭和免疫排斥所削弱。此外，我们鉴定了铁死亡信号通路，其关键因子FTH1与癌细胞干性和转移密切相关。本研究阐明了淋巴结转移性NSCLC的转移和免疫逃逸机制，为靶向治疗提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 非小细胞肺癌淋巴结转移的细胞和空间特征及其免疫逃逸机制尚不清楚，本研究旨在解析参与淋巴结转移的肿瘤微环境特征。
- 核心机制
- NSCLC淋巴结转移涉及肿瘤细胞干性（与FTH1及铁死亡信号相关）、恶性细胞来源免疫球蛋白（尤其IGHG4）、SPP1+IFI30+巨噬细胞、CXCL13+T细胞耗竭和成纤维细胞介导的免疫排斥等共同作用。
- 主要证据
- 对配对转移淋巴结和原发肿瘤进行scRNA-seq和空间转录组分析，结合公共数据集验证；体外敲低FTH1和IGHG4降低EMT标志物和侵袭能力，FTH1敲低在裸鼠中减少肺转移结节。
- 研究意义
- 研究阐明了淋巴结转移性NSCLC的转移和免疫逃逸机制，为靶向治疗提供见解，并提示FTH1等分子作为潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞类型鉴定与肿瘤微环境组成比较
鉴定主要细胞类型并比较转移淋巴结、原发肿瘤及对照样本的细胞组成差异。
对scRNA-seq数据整合聚类，基于经典标记基因注释9种主要细胞类型，比较不同样本类型的细胞比例。
上皮细胞干性分析
评估转移淋巴结和原发肿瘤中上皮细胞的干性程度及其与预后的关系。
重新聚类上皮细胞，使用CytoTRACE评分评估干性，分析干性相关基因和通路，并在TCGA-LUAD中评估CSC评分与生存的关系。
免疫球蛋白高表达恶性细胞鉴定及空间特征分析
探究恶性细胞中免疫球蛋白基因表达升高及其空间分布和免疫检查点表达。
基于CNV推断区分恶性和非恶性上皮细胞，聚类鉴定免疫球蛋白高表达恶性细胞，比较其干性、通路富集和CD274表达；空间转录组划分肿瘤核心区和外周区并比较基因表达。
成纤维细胞亚群及免疫排斥空间结构分析
解析成纤维细胞亚群在肿瘤边缘形成免疫排斥屏障的作用。
重新聚类成纤维细胞和内皮细胞，鉴定CST1+成纤维细胞等亚群，分析细胞邻域和空间距离，评估成纤维细胞与免疫细胞的相关性。
髓系细胞亚群及免疫抑制功能分析
鉴定SPP1+IFI30+巨噬细胞等髓系亚群及其与T细胞和恶性细胞的相互作用。
重新聚类髓系细胞，鉴定11个亚群，比较样本间比例差异，分析SPP1+IFI30+巨噬细胞的基因表达、细胞通讯和空间分布。
T/NK细胞和B/浆细胞亚群及耗竭分析
评估转移淋巴结和原发肿瘤中T细胞耗竭、Treg富集及B细胞活化和浆细胞抗体类型。
重新聚类T/NK细胞和B/浆细胞，计算耗竭评分，分析CXCL13+T细胞与LS样结构的空间共定位，比较浆细胞亚群免疫球蛋白表达。
LUAD与LUSC淋巴结转移机制差异分析
比较LUAD和LUSC在淋巴结转移中的细胞组成差异。
分别量化LUAD和LUSC中转移淋巴结阳性原发肿瘤相对于正常肺或淋巴结阴性原发肿瘤的细胞比例变化。
关键特征在公共数据集中的验证
在独立数据集中验证CSC、SPP1+IFI30+巨噬细胞和CXCL13+T细胞特征评分与淋巴结转移和预后的关联。
在GSE127465、GSE123904、GSE131907等数据集中计算特征评分，比较N0/N1、原发/转移灶及正常组织的差异；TCGA-LUAD聚类和生存分析。
FTH1和IGHG4功能验证
验证FTH1和IGHG4在肺癌细胞上皮-间质转化、增殖、侵袭和体内转移中的作用。
在A549和H460细胞中敲低FTH1或IGHG4，检测EMT标志物蛋白表达、细胞增殖和Transwell侵袭；FTH1敲低细胞尾静脉注射裸鼠观察肺转移结节。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本与模型特征验证
体内效果评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Bimake | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Bimake | -- | |
| EASY Ⅱ蛋白定量试剂盒 | Transgene | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| FTH1抗体 | Cell Signaling Technology | 3998 | |
| E-cad抗体 | BD Biosciences | 610182 | |
| Vimentin抗体 | Proteintech | 60330-1-Ig | |
| MMP2抗体 | Proteintech | 10373-2-AP | |
| MMP9抗体 | Proteintech | 10375-2-AP | |
| ZEB1抗体 | Proteintech | 21544-1-AP | |
| Twist抗体 | Proteintech | 25465-1-AP | |
| GPX4抗体 | Cell Signaling Technology | 52455 | |
| IGHG4抗体 | Proteintech | 66408-1-Ig | |
| N-cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| ZEB2抗体 | Proteintech | 14026-1-AP | |
| Vinculin抗体 | Santa Cruz | sc-73614 | |
| Actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 山羊抗兔二抗 | Jackson | 115-005-003 | |
| 山羊抗鼠二抗 | Jackson | 115-035-003 | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| Transwell侵袭 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 结晶紫 | Sorabio | -- | |
| 单细胞组织解离 | sCelLiveTM组织保存液 | Singleron | -- |
| sCelLiveTM组织解离液 | Singleron | -- | |
| GEXSCOPE®红细胞裂解液 | Singleron | -- | |
| 单细胞测序 | GEXSCOPE®单细胞RNA文库试剂盒 | Singleron | -- |
| 空间转录组 | Visium空间组织优化载玻片及试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Visium空间基因表达载玻片及试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本与伦理 | 患者纳入标准：19例NSCLC伴淋巴结转移，未接受术前抗肿瘤治疗；样本类型和数量：转移淋巴结n=22，原发肿瘤n=20，癌旁正常肺n=4；空间转录组4例配对样本 阅读提示：Methods-Patient samples；Fig. 1A；Supplementary Data 1 |
| scRNA-seq与空间转录组数据处理 | 质控标准：nCount_RNA<1000或nFeature_RNA<300或线粒体比例>25%被排除；整合分析使用Monocle3，批次校正使用align_cds；空间聚类使用BayesSpace q=21 阅读提示：Methods-Integrative clustering analysis of scRNA-seq data；Spatial transcriptomics pre-processing；Integrative analysis of ST data |
| 肿瘤核心区和外周区划分 | 基于上皮spot到非上皮spot的最小欧氏距离，以中位数为界划分核心/外周区；样本量n=4对 阅读提示：Methods-Determination of tumor core and peripheral partitions for epithelial spots |
| 细胞亚群鉴定与评分 | 上皮细胞亚群注释标记基因；CytoTRACE默认参数；CSC评分基于CytoTRACE相关系数>0.5的基因；免疫球蛋白高表达定义（平均表达>10，Bonferroni校正P<0.01） 阅读提示：Methods-Identification of epithelial cell sub-populations；CytoTRACE analysis about the epithelial cells；Identification and clustering analysis of malignant cells |
| FTH1/IGHG4敲低功能实验 | 细胞系A549和H460；shRNA序列（FTH shRNA1/2，IGHG4 shRNA1/2）；转染试剂PEI与质粒比例1:3；慢病毒感染使用5 μg/ml polybrene 8–24 h；Western blot抗体稀释比例；Transwell接种5×10^4细胞，24 h；CCK-8接种0.8×10^3或1.5×10^3细胞，检测0–96 h 阅读提示：Methods-Transfection and lentivirus production；Immunoblotting assay；Cell proliferation assay；Transwell migration assay；Fig. 7G,H；Supplementary Fig. 10F–L |
| 体内肺转移实验 | 小鼠品系：雄性BALB/c裸鼠6–8周龄；细胞接种量2×10^6/只，尾静脉注射；观察时间10周；每组n=6（转移结节计数）；伦理批准号LNCH20210104 阅读提示：Methods-In vivo animal studies；Fig. 7I,J；Supplementary Fig. 10M |