临床样本与动物模型中asprosin表达检测
明确asprosin是否参与病理性心肌肥大
检测高血压心衰患者与非心衰患者血浆asprosin水平及其与NT-proBNP、EF的相关性；检测TAC和ISO小鼠心脏及血浆asprosin表达。
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YY1/Asprosin/PFKP轴调控糖酵解代谢并加重病理性心肌肥大
YY1/Asprosin/PFKP axis regulates glycolytic metabolic and exacerbates pathological cardiac hypertrophy.
实验完整度
高含患者血浆样本、NMCMs及HEK-293T体外模型、TAC与Ang II动物模型，并有Co-IP、泛素化、ChIP等机制验证
主要模型
高血压心衰患者血浆样本 原代新生小鼠心肌细胞（NMCMs） TAC及Ang II诱导的小鼠心肌肥大模型 HEK-293T细胞
重点核对
AAV9尾静脉注射剂量2×10^11 v.g./只，TAC术前3周给予 Ang II处理NMCMs终浓度2μM，处理48h MG132浓度50μM处理6h用于泛素化检测 CHX浓度100ng/mL用于PFKP半衰期检测 TAC术后4周行超声心动图检测
摘要
在肥厚和衰竭的心脏中，燃料代谢被重编程为糖酵解增强。在本研究中，我们鉴定出脂肪因子asprosin是病理性心肌肥大中该过程的关键调控因子。在患者中，循环asprosin水平与NT-proBNP和EF相关。心肌细胞特异性asprosin过表达加重雄性小鼠的肥大、异常糖酵解并损害线粒体ATP生成，而其缺失对雄性/雌性小鼠中TAC或Ang II诱导的重塑发挥保护作用。机制上，asprosin结合PFKP并抑制DTX3L介导的K48连接泛素化，从而稳定PFKP并驱动异常糖酵解、PDK4诱导、PDH抑制和呼吸受损。PFKP基因敲低减轻雄性小鼠的肥大和纤维化，而PFKP过表达则消除FBN1敲低所赋予的保护作用。此外，YY1被鉴定为雄性小鼠肥厚心脏中asprosin的转录激活因子。在此我们表明，YY1–asprosin–PFKP–PDK4–PDH轴是代谢重塑的基础，并强调血浆asprosin作为心功能障碍的潜在早期生物标志物和治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- asprosin在病理性心肌肥大中是否调控糖酵解代谢，其分子机制及上游转录调控如何。
- 核心机制
- YY1转录激活asprosin；asprosin结合PFKP并竞争性抑制DTX3L与PFKP结合，减少PFKP的K48连接泛素化降解，稳定PFKP，驱动异常糖酵解、PDK4上调及PDH磷酸化抑制，损害线粒体ATP合成。
- 主要证据
- 患者血浆asprosin与NT-proBNP正相关、与EF负相关；AAV9介导心肌细胞asprosin过表达加重TAC小鼠肥大而shFBN1敲低保护；ECAR/OCR显示糖酵解增强、呼吸受损；Co-IP、His-pulldown及泛素化实验证实asprosin-PFKP-DTX3L相互作用；PFKP敲低减轻肥大，PFKP过表达消除shFBN1保护；ChIP与双荧光素酶证实YY1结合FBN1启动子。
- 研究意义
- 揭示YY1–asprosin–PFKP–PDK4–PDH轴是病理性心肌肥大代谢重塑的基础，并提示血浆asprosin可作为心功能障碍的潜在早期生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
心肌细胞特异性asprosin过表达与缺失的体内功能验证
验证asprosin对病理性心肌肥大的因果作用
尾静脉注射AAV9-cTnT-Asprosin或AAV9-cTnT-shFBN1，行TAC手术，检测心功能、心重比、组织学和标志基因。
NMCMs中asprosin对糖酵解和线粒体功能的调控
验证asprosin对心肌细胞糖酵解通量和线粒体呼吸的影响
在Ang II诱导的NMCMs肥大模型中过表达或敲低asprosin，检测ECAR、OCR、葡萄糖摄取、乳酸分泌、ATP含量和线粒体膜电位。
asprosin与PFKP相互作用的鉴定
寻找asprosin调控糖酵解的下游靶蛋白
Co-IP联合质谱筛选asprosin互作蛋白，通过Co-IP、免疫荧光共定位、His-pulldown及结构域截短和突变验证asprosin与PFKP直接结合。
asprosin通过抑制DTX3L介导的PFKP泛素化稳定PFKP
阐明asprosin上调PFKP蛋白的翻译后修饰机制
检测asprosin对PFKP蛋白和mRNA水平的影响，CHX和MG132处理检测PFKP稳定性与泛素化，鉴定DTX3L为PFKP的E3泛素连接酶并验证asprosin竞争性抑制DTX3L-PFKP结合。
PFKP在asprosin促肥大效应中的必要性验证
验证PFKP是asprosin促心肌肥大的下游关键节点
心肌细胞特异性敲低PFKP观察TAC小鼠表型；在shFBN1基础上过表达PFKP，检测心功能、纤维化、糖酵解及PDK4-PDH轴变化。
YY1对asprosin的转录调控验证
阐明病理性刺激下asprosin表达上调的上游机制
数据库预测FBN1启动子转录因子，ChIP和双荧光素酶报告基因验证YY1结合FBN1启动子−1022至−1011bp并调控asprosin表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 心肌细胞分离 | EDTA | Meilunbio | MA0232 |
| 免疫荧光鉴定心肌细胞 | 抗α-actinin抗体 | Genetex | GTX11007 |
| H&E染色 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | G1120 |
| Masson染色 | Masson染色试剂盒 | Solarbio | G1340 |
| WGA染色 | 小麦胚芽凝集素 | Invitrogen | W11261 |
| 内源性过氧化物酶封闭液 | Elabscience | E-IR-R115 | |
| 柠檬酸钠抗原修复液 | Solarbio | C1032 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X） | Beyotime | P0015 | |
| 硝酸纤维素膜 | LABSELECT | TM-NC-R-22 | |
| 抗Asprosin抗体 | Finetest | FNab09797 | |
| 抗β-MHC抗体 | Proteintech | 22280-1-AP | |
| 抗ANP抗体 | Affinity | DF6497 | |
| 抗PFKP抗体 | Proteintech | 13389-1-AP | |
| 抗PFKP抗体 | Proteintech | 68129-1-Ig | |
| 抗DTX3L抗体 | Abclonal | A18551 | |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 81290-1-RR | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| PDK4抗体 | Proteintech | 12949-1-AP | |
| 磷酸化PDH抗体 | Abcam | ab177461 | |
| PDH抗体 | Proteintech | 18068-1-AP | |
| PFKL抗体 | Genetex | GTX105697 | |
| PFKM抗体 | Proteintech | 55028-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗α-Tubulin抗体 | Finetest | FNab0033 | |
| 抗His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| 抗FBN1抗体 | Immunoway | YT1684 | |
| 抗泛素抗体 | Abcam | Ab134953 | |
| 荧光标记抗兔IgG二抗 | LI-COR Bio-Science | 926-32211 | |
| 荧光标记抗鼠IgG二抗 | LI-COR Bio-Science | 926-32210 | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR | Odyssey CLx 9140 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| 逆转录试剂盒 | Toyobo | FSQ-101 | |
| SYBR qPCR预混液 | Toyobo | QPX-201 | |
| NanoDrop 8000分光光度计 | ThermoFisher | -- | |
| Quant Studio™ 6 Flex实时PCR系统 | ABI | -- | |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Beyotime | P2078 |
| 37%甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 甘氨酸 | Solarbio | 56-40-6 | |
| PMSF | Beyotime | ST505 | |
| 抗YY1抗体 | CST | 46395 | |
| 抗KLF4抗体 | Proteintech | 11880-1-Ap | |
| DNA纯化试剂盒 | Beyotime | D0033 | |
| DEPC水 | Solarbio | R1600 | |
| ELISA | asprosin酶联免疫吸附检测试剂盒 | Finetest | EM1707 |
| 代谢物检测 | 乙酰辅酶A检测试剂盒 | Elabscience | E-EL-0125 |
| ATP检测试剂盒 | Abbkine | KTB1016 | |
| PDH活性检测 | PDH活性微孔板检测试剂盒 | Abbkine | KTB1270 |
| NMCMs分离培养 | 0.25%胰酶-EDTA | Beyotime | C0201 |
| II型胶原酶 | Gibco | 17101015 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11885500BT | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | Seven | SC118 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668030 |
| 免疫荧光染色 | Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 山羊血清 | Boster | AR0009 | |
| Alexa-Fluor 594/488标记抗兔/鼠IgG抗体 | Abbkine | A23410, A23420, A23220, A23210 | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | FV300 | |
| RNA-seq | NEBNext® Ultra™ RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- |
| Agilent Bioanalyzer 2100系统 | Agilent | -- | |
| Co-IP | Pierce™免疫沉淀试剂盒 | Thermo Scientific | 26149 |
| 泛素化检测 | MG132 | MCE | HY-13259 |
| Protein A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 | |
| LC-MS/MS | RIPA裂解液 | ThermoFisher | 89901 |
| 考马斯亮蓝快速染色液 | Beyotime | P0017 | |
| 乳酸和葡萄糖检测 | 乳酸检测试剂盒 | Abbkine | KTB1100 |
| 葡萄糖检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Beyotime | S0201S |
| 葡萄糖摄取检测 | 葡萄糖摄取检测试剂盒 | Dojindo | UP02 |
| 线粒体膜电位检测 | TMRE染色试剂 | Beyotime | C2001S |
| Seahorse代谢检测 | Seahorse XFe 96细胞能量代谢分析系统 | Agilent | -- |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| 双荧光素酶报告基因检测 | 双荧光素酶系统试剂盒 | Promega | E1910 |
| His-pulldown | Pierce™ PolyHis蛋白下拉试剂盒 | Thermo Scientific | 21277 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 患者分组依据（高血压心衰伴心肌肥厚vs正常成人）、样本量（n=20、27）、纳入排除标准 阅读提示：Methods中Human clinical samples小节及Table S1 |
| 动物TAC模型 | 小鼠品系、周龄、性别、麻醉剂量（戊巴比妥钠60mg/kg）、TAC术后4周检测时间点 阅读提示：Methods中Mouse TAC model and echocardiography小节 |
| AAV9体内干预 | 病毒血清型、剂量（2×10^11 v.g./只）、注射途径、TAC术前3周给药时间点 阅读提示：Methods中Animal adeno-associated virus (AAV)-treatment小节 |
| NMCMs体外处理 | Ang II终浓度2μM、处理48h、转染质粒量2000ng或siRNA 50μM 阅读提示：Methods中Isolation and culture of primary neonatal mouse cardiomyocytes及Cell culture and treatment小节 |
| 泛素化与蛋白稳定性检测 | MG132 50μM处理6h、CHX 100ng/mL、免疫沉淀用抗体 阅读提示：Methods中Ubiquitylation assays小节及Fig. 5图注 |
| Seahorse代谢检测 | ECAR与OCR检测试剂盒货号、加药顺序（葡萄糖、oligomycin、2-DG、FCCP、Rot&AA） 阅读提示：Methods中Seahorse小节及Fig. 3图注 |