纳米颗粒合成与表征
制备具有光热和催化性能的Cu@Fe3O4纳米颗粒并验证其理化特征。
通过热分解法合成Cu@Fe3O4核壳纳米颗粒，并进一步修饰DSPE-PEG-NH2和AS1411；使用TEM、HRTEM、XPS、XRD和ICP-AES进行表征。
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基于铁死亡的纳米疗法改善结直肠癌相关成纤维细胞介导的免疫抑制微环境
Amelioration of colorectal cancer-associated fibroblasts in immunosuppressive microenvironment by ferroptosis-based nanotherapy.
实验完整度
高包含体外细胞、皮下瘤、Apc-KO、PDX和类器官模型，并进行铁死亡及免疫机制验证
主要模型
人结直肠癌CAFs与NFs原代细胞 CT26+BALB/3T3及MC38+NIH3T3皮下共接种小鼠模型 Apc-KO结直肠癌基因工程小鼠模型 患者来源异种移植（PDX）与类器官（PDO）模型
重点核对
CAFs铁死亡验证：NPs处理后Fe2+升高、LPO增加、GPX4剂量依赖性降低 铁/铜离子螯合验证：DFO和TM分别及联合逆转NPs细胞毒性和LPO 趋化因子验证：NPs上调CCL3、下调CXCL12，并激活DC和CD8+ T细胞 体内抑瘤验证：NPs-AS1411联合808 nm激光在皮下瘤、Apc-KO、PDX模型中抑瘤最强 靶向特异性验证：AS1411修饰增加CAFs和肿瘤细胞对NPs的摄取
摘要
大多数结直肠癌（CRC）对肿瘤免疫治疗不敏感，这是由于癌症相关成纤维细胞（CAFs）的促肿瘤活性和免疫抑制作用深刻驱动了癌症进展。在此，我们提供了一种基于磁性纳米颗粒、靶向CAFs以重塑CRC结构和免疫肿瘤微环境的治疗策略。这些纳米颗粒不仅通过铁和铜离子的协同效应诱导CAFs增强的铁死亡，而且改善免疫抑制性肿瘤微环境，同时打破物理障碍并激活免疫系统。机制上，这些纳米颗粒调节CAFs的内在信号通路并改变趋化因子分泌，以改善树突状细胞的成熟以及CD8+ T细胞的活化和功能，最终增强免疫反应以抑制CRC生长。此外，我们在患者来源的异种移植和类器官模型中验证了该策略的有效性，进一步说明了其普遍性和有希望的临床转化潜力。总之，我们表明靶向CAFs的磁性纳米颗粒可以通过打破物理屏障和减轻免疫抑制来重编程CRC的肿瘤微环境，为临床CRC管理的治疗策略提供了有希望的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过靶向CAFs的磁性纳米颗粒诱导铁死亡并重塑免疫微环境，从而改善结直肠癌对免疫治疗的敏感性并抑制肿瘤生长。
- 核心机制
- Cu@Fe3O4纳米颗粒通过Fe2+介导的ROS生成和Cu2+介导的GPX4下调协同诱导CAFs铁死亡，并调节CCL3/CXCL12等趋化因子分泌，促进DC成熟和CD8+ T细胞活化，从而逆转CAFs介导的免疫抑制。
- 主要证据
- 体外CAFs中铁死亡指标、螯合剂 rescue、RNA-seq和趋化因子检测；皮下共接种瘤、Apc-KO、PDX和PDO模型中NPs-AS1411联合激光的抑瘤效果及免疫细胞功能分析。
- 研究意义
- 该策略通过打破物理屏障和减轻免疫抑制重编程CRC肿瘤微环境，在PDX和类器官模型中验证了普遍性，为临床CRC治疗提供了有希望的途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CAFs分离鉴定与体外杀伤评估
确认CAFs特征并比较NPs对CAFs和NFs的杀伤及摄取差异。
从CRC组织和癌旁正常组织分离CAFs和NFs，Western blot鉴定标志物；CCK-8评估细胞毒性，Bio-TEM观察摄取，Calcein-AM/PI检测细胞死亡。
铁死亡机制验证
验证NPs是否通过Fe2+和Cu2+协同诱导CAFs铁死亡。
检测细胞内Fe2+、LPO和GPX4表达；使用DFO和TM分别或联合螯合Fe2+和Cu2+，评估细胞活力、Fe2+、LPO和GPX4变化。
CAFs分泌组对CRC细胞的影响及信号通路分析
评估NPs处理后的CAFs条件培养基对CRC细胞增殖、迁移和EMT的影响，并分析CAFs内在信号通路变化。
收集NFs、CAFs及NPs处理CAFs的条件培养基处理HCT116细胞，进行CCK-8、Transwell和Western blot；对NPs处理CAFs进行RNA-seq、GO/KEGG/GSEA分析，并验证CCL3、CXCL12、CCR7及MAPK/NF-κB/AKT通路。
体内免疫调节与抑瘤效果评估
在皮下共接种瘤模型中验证NPs对CAFs相关免疫微环境的调节和抑瘤作用。
建立CT26+BALB/3T3和MC38+NIH3T3皮下瘤模型，静脉注射NPs，检测肿瘤生长、CCL3/CXCL12、DC成熟和CD8+ T细胞活化与功能。
AS1411靶向特异性验证
确认AS1411修饰的NPs对CAFs和肿瘤细胞的靶向能力及脱靶情况。
结合scRNA-seq和亚细胞蛋白定位筛选表面靶标，鉴定核仁素（NCL）表达；分离肿瘤微环境不同细胞，流式检测NPs和NPs-AS1411摄取。
协同治疗策略体内验证
评估NPs-AS1411联合808 nm激光（PTT/CDT/免疫治疗）在皮下瘤和Apc-KO模型中的协同抑瘤效果。
在CT26+BALB/3T3和MC38+NIH3T3皮下瘤六组模型中静脉注射NPs或NPs-AS1411，24 h后激光照射；在Apc-KO小鼠13、14、15周龄腹腔注射NPs或NPs-AS1411，18周评估肠道肿瘤。
患者来源模型验证
在PDX和PDO模型中验证该策略的转化潜力及对正常组织的毒性。
在PDX六组模型中静脉注射NPs或NPs-AS1411，24 h后激光照射，监测肿瘤生长和温度；在PDX来源共培养细胞和CRC/正常结肠类器官中评估杀伤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 纳米颗粒合成 | 1-十八烯 | Alfa Aesar | -- |
| 油酸 | Alfa Aesar | -- | |
| 油胺 | J & K | -- | |
| 纳米颗粒表面修饰 | 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 | Aldrich | -- |
| N-羟基琥珀酰亚胺 | Aldrich | -- | |
| AS1411适配体 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Invitrogen | -- |
| RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞毒性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | DOJINDO | -- |
| 活/死细胞染色 | Calcein-AM/PI双染试剂盒 | Yeasen | 40747ES76 |
| 细胞内ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033 |
| 细胞内Fe2+检测 | FerroOrange试剂盒 | Dojindo | -- |
| 亚铁离子含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5415 | |
| 脂质过氧化检测 | Liperfluo脂质过氧化探针 | Dojindo | -- |
| 免疫荧光 | Ki67抗体 | Abcam | ab16667 |
| CEA抗体 | Huabio | ET1705-52 | |
| α-SMA抗体 | STARTER | S0B2103 | |
| Vimentin抗体 | Huabio | ET1610-39 | |
| 核仁素抗体 | Abcam | ab129200 | |
| CTNNB1抗体 | Proteintech | 51067-2-AP | |
| 山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 594） | Abcam | ab150080 | |
| ELISA | 人CCL3 ELISA试剂盒 | Solaribio | SEKH-0246 |
| 人CXCL12 ELISA试剂盒 | Solaribio | SEKH-0310 | |
| 小鼠CCL3 ELISA试剂盒 | Solaribio | SEKM-0112 | |
| 小鼠CXCL12 ELISA试剂盒 | Solaribio | SEKM-0050 | |
| 类器官培养 | 人结肠类器官试剂盒 | Biogenous | K2003-HC |
| 结直肠癌类器官试剂盒 | Biogenous | K2103-CR | |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Glo 3D试剂 | Promega | G9681 |
| 免疫组化 | 免疫组化染色试剂盒 | Yeasen | 36311ES50 |
| CD8a抗体 | Servicebio | GB15068-100 | |
| CD86抗体 | Servicebio | GB150054-100 | |
| 流式细胞术 | CD45抗体 | Biolegend | 103111 |
| CD3抗体 | Biolegend | 100335 | |
| CD8a抗体 | Biolegend | 100733 | |
| T-bet抗体 | Biolegend | 644809 | |
| Eomes抗体 | Biolegend | 157703 | |
| CD107a抗体 | Biolegend | 121613 | |
| IFN-γ抗体 | Biolegend | 113603 | |
| TNF-α抗体 | Biolegend | 506323 | |
| CD80抗体 | Biolegend | 104707 | |
| CD86抗体 | Biolegend | 105027 | |
| MHC II抗体 | Biolegend | 107605 | |
| CD11c抗体 | Biolegend | 117317 | |
| CD11b抗体 | Biolegend | 101215 | |
| F4/80抗体 | Biolegend | 111603 | |
| CD19抗体 | Biolegend | 152407 | |
| CD31抗体 | Biolegend | 102409 | |
| Ep-CAM抗体 | Biolegend | 118205 | |
| α-SMA抗体 | Absin | abs172181 | |
| CD8+ T细胞功能实验 | BD GolgiStop试剂 | BD Biosciences | -- |
| Cytofix/Cytoperm缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| GoScript逆转录酶 | Promega | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Toyobo Life Science | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | -- |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4691T | |
| 磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| NF-κB (p65)抗体 | Cell Signaling Technology | 8242T | |
| 磷酸化NF-κB (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033T | |
| MAPK (p38)抗体 | Cell Signaling Technology | 8690T | |
| 磷酸化MAPK (Thr180/Tyr182)抗体 | Cell Signaling Technology | 4511T | |
| E-Cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 3195s | |
| N-Cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 13116s | |
| Vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741s | |
| β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A1978 | |
| RNA提取 | 总RNA纯化试剂盒 | GeneMarkbio | -- |
| RNA-seq文库构建 | VAHTS Universal V6 RNA-seq文库构建试剂盒 | -- | -- |
| 动物实验 | Apc-KO小鼠品系 | Cyagen Biosciences | C001511 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAFs与NFs分离及细胞毒性 | CAFs和NFs来源与例数、NPs处理浓度按Fe浓度计算、CAFs IC50 2.63 μM、NFs IC50 12.26 μM、处理24 h 阅读提示：Methods中Isolation and culture of NFs and CAFs及In vitro cytotoxicity assay，图2c |
| 铁死亡机制验证 | NPs处理24 h、FerroOrange 1 μM 30 min、Liperfluo 10 μM 30 min、DFO和TM螯合处理分组 阅读提示：Methods中Measurement of intracellular ferrous ions、Liperfluo staining for LPO及图2f–l |
| 皮下瘤模型给药与激光 | 细胞接种数量、NPs 20 mg/kg 200 μl静脉注射时间点、808 nm激光0.25 W/cm² 5 min、每组n=5或n=6 阅读提示：Methods中Animals and subcutaneous cancer mouse models、In vivo treatment experiments及图4、图6 |
| Apc-KO模型给药 | Apc-KO小鼠周龄13、14、15周腹腔注射、18周龄评估、NPs和NPs-AS1411剂量20 mg/kg 阅读提示：Methods中Apc-KO mouse model及图6j–o |
| PDX与类器官模型处理 | PDX给药时间点22、34、46天、激光参数、类器官处理顺序与时间、NPs剂量20 mg/kg 阅读提示：Methods中Patient-derived xenograft models、Isolation establishment and maintenance of PDOs、Organoid viability assay及图7 |