人牙发育单细胞与空间转录组图谱构建
建立从起始到萌出阶段的人牙发育细胞图谱并解析DE与DPL的空间分布。
收集7–8至24 PCW及13–15岁牙胚组织，进行scRNA-seq和ST，整合分析并注释细胞类型，用RNAscope和IF验证KRT14、FGF3等标志物。
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上皮细胞与间充质细胞之间的时空相互作用驱动人牙本质发生
Spatiotemporal interplay between epithelial and mesenchymal cells drives human dentinogenesis.
实验完整度
高含scRNA-seq与ST图谱、体外诱导与共培养、肾被膜重组及小鼠牙损伤模型，并进行功能与机制验证
主要模型
人胚胎牙胚组织（7–8至24 PCW） DLX6-AS1+ DMSCs与DLX6-AS1+ DPSCs 肾被膜下组织重组模型（裸鼠） 裸鼠磨牙牙髓暴露损伤模型
重点核对
WNTs（WNT6、WNT7B、WNT10B）10 ng/ml处理7天后换JAG1 10 ng/ml处理7天，每2天换液 DLX6-AS1+细胞通过DLX6-AS1启动子驱动EGFP慢病毒报告系统分离，嘌呤霉素1 μg/ml筛选6天 共培养中DE细胞转染WLS或JAG1 siRNA（40 nmol/L），DLX6-AS1+ DMSCs以2.5×10^4细胞/孔接种于Transwell上室共培养7天 肾被膜重组：1×10^5细胞/0.25 μL与Cellmatrix Type I-A凝胶化后移植，3个月后取材 裸鼠磨牙牙髓暴露后注射WNTs预处理的DLX6-AS1+ DPSCs与JAG1，21天后取材
摘要
牙齿牙本质由成牙本质细胞分泌，构成牙齿结构的大部分并提供支撑和感觉功能。然而，牙本质缺损很常见，一旦超过临界阈值便无法修复。人牙本质在牙上皮（DE）的引导下由牙乳头（DP）细胞发育而来。在此，我们利用单细胞RNA测序和空间转录组学，呈现了从起始到萌出阶段的人牙齿发育图谱，重点关注上皮-间充质相互作用。该图谱揭示DE以WNT-NOTCH序贯激活模型调控DP分化，并鉴定了关键信号分子。DLX6-AS1+ DP细胞响应牙上皮信号，可从成人牙髓干细胞（DPSCs）中分离。值得注意的是，DLX6-AS1+ DPSCs在牙本质缺损的体内疾病模型中成功生成管状牙本质。该研究为人类牙齿发育提供了宝贵信息，并为修复再生牙组织奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人牙发育过程中牙上皮如何引导牙乳头细胞分化为成牙本质细胞，以及这些信号能否用于牙本质再生。
- 核心机制
- DE来源的WNT信号早期主导DP增殖与 priming，随后NOTCH信号增强，形成WNT-NOTCH序贯激活；DLX6-AS1+ DP细胞响应上述信号并分化为成牙本质细胞。
- 主要证据
- scRNA-seq与ST图谱显示DE表达WNT/NOTCH配体而DPL表达受体及靶基因LEF1、HEY1；体外WNT-NOTCH序贯刺激增强DLX6-AS1+ DMSCs/DPSCs矿化与DSPP表达；肾被膜重组和小鼠牙损伤模型显示管状牙本质形成与牙本质桥修复。
- 研究意义
- 为人类牙齿发育提供信息，并基于发育信号建立利用DLX6-AS1+ DPSCs进行牙本质再生修复的策略基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
WNT与NOTCH信号时空表达及“中继”模式解析
明确DE与DPL中WNT/NOTCH配体-受体表达格局及其随发育阶段的动态变化。
分析scRNA-seq中WNT、NOTCH等通路配体与受体表达比例，用气泡热图、Sankey图和CellChat预测细胞通讯，并用IF验证关键蛋白及下游靶点LEF1、HEY1。
DLX6-AS1+ DP细胞亚群鉴定与信号响应分析
确定响应DE信号的DP亚群及其分子特征。
对DPL进行亚聚类和轨迹分析，比较DLX6-AS1+ DP与NR2F1+TWIST1+ DP的差异表达，用RNAscope验证DLX6-AS1空间定位，分析WNT/NOTCH靶基因和成牙相关基因相关性。
WNT-NOTCH序贯刺激促进DLX6-AS1+细胞成牙分化（体外）
验证WNT-NOTCH序贯信号对DLX6-AS1+ DMSCs和DPSCs成牙分化的作用。
用DLX6-AS1启动子EGFP报告系统分离DLX6-AS1+细胞，进行WNTs 7天→JAG1 7天序贯处理，检测DSPP、LEF1、HEY1、ALP和ARS染色，并用DE共培养及WLS/JAG1敲低验证上皮信号必要性。
肾被膜重组模型验证体内牙本质生成
验证WNT-NOTCH序贯信号能否指导DLX6-AS1+ DMSCs在体内形成牙本质样结构。
将DLX6-AS1+ DMSCs与人非牙源性角质形成细胞重组，经WNTs预处理并邻近放置JAG1浸泡珠，移植于裸鼠肾被膜下，3个月后行Masson、DSPP IF和MicroCT分析。
小鼠磨牙牙髓损伤模型验证牙本质再生
评估WNT-NOTCH序贯激活的DLX6-AS1+ DPSCs修复牙本质缺损的能力。
在裸鼠上颌第一磨牙制备牙髓暴露，注射WNTs预处理的DLX6-AS1+ DPSCs与JAG1，用MicroCT、Masson、DSPP IF、SEM和qPCR评估再生牙本质。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | 中性蛋白酶II | Gibco | 17105041 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Gibco | 10104159001 | |
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | Gibco | A15170-01 |
| α-MEM培养基 | Gibco | 12561072 | |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| WNT-NOTCH序贯刺激 | WNT6重组蛋白 | OriGene | TP762653 |
| WNT7B重组蛋白 | CUSABIO | CSB-EP026142HU | |
| WNT10B重组蛋白 | CUSABIO | CSB-EP026130HU | |
| JAG1重组蛋白 | MCE | HY-P70399 | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma Aldrich | P8833 |
| 共培养转染 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778030 |
| Opti-MEM培养基 | Invitrogen | 31985070 | |
| Western blot | Mini-PROTEAN TGX预制胶 | Bio-Rad | 4561093 |
| Trans-Blot Turbo转膜系统 | Bio-Rad | 1704156 | |
| 抗DSPP抗体 | Proteintech | 55396-1-AP | |
| 抗LEF1抗体 | Proteintech | 14972-1-AP | |
| 抗HEY1抗体 | Proteintech | 19929-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| ALP染色 | 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Sigma Aldrich | MAK530 |
| ARS染色 | 茜素红S | Sigma Aldrich | A5533 |
| ARS定量 | 氯化十六烷基吡啶 | Sigma Aldrich | C5911 |
| 免疫荧光 | 抗DSPP抗体 | Abcam | ab216892 |
| 抗Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | 9129 | |
| 抗KRT14抗体 | Abcam | ab119695 | |
| 抗WNT6抗体 | Abcam | ab50030 | |
| 抗WNT7B抗体 | Proteintech | 10605-1-AP | |
| 抗WNT10B抗体 | Abcam | ab70816 | |
| 抗LRP6抗体 | Santa Cruz | sc-25317 | |
| 抗JAG1抗体 | Abcam | ab300561 | |
| 抗NOTCH2抗体 | Abcam | ab313453 | |
| 抗DKK1抗体 | Abcam | ab61034 | |
| 抗SFRP1抗体 | Proteintech | 26460-1-AP | |
| 抗GFP抗体 | CST | 2956 | |
| RNAscope | RNAscope多重荧光检测 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 |
| DLX6-AS1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 569491-C2 | |
| TSA Plus花菁3 | PerkinElmer | NEL751A | |
| qRT-PCR | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | 04379012001 | |
| SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 172-5270 | |
| 肾被膜重组 | I-A型细胞基质 | Nitta Gelatin Inc | 631-00651 |
| 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（75:25） | MCE | HY-B2247A | |
| 牙髓暴露模型 | 玻璃离子水门汀 | 3M ESPE | 56906 |
| 组织学染色 | Masson三色染色试剂盒 | Servicebio | G1006 |
| MicroCT分析 | SkyScan 1276微型CT系统 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人牙胚样本scRNA-seq与ST | 发育阶段、每阶段生物学重复数（n=2）、每个重复包含的牙胚类型及来源胚胎 阅读提示：Methods的Tissue collection小节；Fig. 1a图注 |
| WNT-NOTCH序贯刺激体外诱导 | WNT6/WNT7B/WNT10B和JAG1浓度（各10 ng/ml）、处理时间（WNTs第1–7天，JAG1第8–14天）及每2天换液 阅读提示：Methods的WNT-NOTCH sequential stimulation小节；Fig. 4c、4d图注 |
| DLX6-AS1+细胞分离 | 慢病毒报告系统构建方式、MOI=50、嘌呤霉素1 μg/ml筛选6天 阅读提示：Methods的DLX6-AS1+ DMSCs and DLX6-AS1+ DPSCs小节；Supplementary Fig. 5a–d |
| DE与DLX6-AS1+ DMSCs共培养 | siRNA浓度40 nmol/L、转染试剂、Transwell接种密度2.5×10^4细胞/孔、共培养7天及“pre+/post+”换室时间点 阅读提示：Methods的Co-culture system小节；Fig. 4f图注 |
| 肾被膜重组模型 | 细胞数量（1×10^5细胞/0.25 μL）、凝胶类型与体积、WNTs预处理方式、JAG1浸泡珠放置、移植后3个月取材及每组n=5 阅读提示：Methods的Recombination and subrenal culture小节；Fig. 5a图注 |
| 小鼠磨牙牙髓损伤模型 | 动物品系与性别（雄性BALB/c裸鼠，8周龄）、牙髓暴露方式、注射细胞与JAG1方式、术后21天取材及每组n=5 阅读提示：Methods的Animals与Tooth damage model小节；Fig. 6a图注 |