建立并优化drGFP高内涵筛选平台
建立可实时监测ER dislocation的1536孔高通量筛选体系，用于发现ERAD调节剂。
将NHK-drGFP报告细胞接种于1536孔板，加入化合物及bortezomib后检测GFP荧光，以NMS-873作为抑制对照，筛选96,047个化合物并对初筛命中物进行剂量-反应复测。
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小分子VDAC配体通过破坏钙稳态抑制ERAD并诱导选择性癌细胞死亡
A small molecule VDAC ligand inhibits ERAD and induces selective cancer cell death via disruption of calcium homeostasis.
实验完整度
高含高内涵筛选、多种癌细胞与正常细胞、CRISPR敲除、光亲和标记质谱、MST、CETSA、脂双层电生理及A375异种移植模型，具功能与机制验证
主要模型
HeLa细胞系（含NHK-drGFP、CD3δ-drGFP报告细胞） 多种癌细胞系与正常人原代细胞 VDAC基因敲除/敲低HeLa细胞 A375黑色素瘤异种移植BALB/c-nu小鼠模型
重点核对
NHK-drGFP与CD3δ-drGFP报告基因检测ER dislocation，225的IC50为1.02 µM CHX chase（50 µg/mL）检测NHK与CD3δ降解，225处理0、1、2、4 h 光亲和探针225-cc（5 µM）竞争80 µM 225，UV 355 nm交联后链霉亲和素富集与质谱鉴定VDAC1/2/3 MST测定225与重组人VDAC1的KD为3.13 µM；CETSA用2 µM 225处理1 h验证热稳定性 A375异种移植：每侧皮下注射2×10⁶细胞，n=8只/组，225每日腹腔注射20 mg/kg
摘要
内质网相关降解（ERAD）是关键的蛋白质质量控制机制，同时也调控脂质代谢和钙稳态。ERAD和未折叠蛋白反应的失调是包括癌症、神经退行性疾病和代谢综合征在内的多种疾病的基础。ERAD的小分子调节剂能够实现机制发现和治疗干预，但目前已鉴定出的很少。通过高内涵筛选，我们发现了若干ERAD调节化合物，包括NCATS-SM0225，一种ERAD抑制剂，它意外地结合所有三种VDAC异构体，VDAC是富集于线粒体相关膜的外线粒体膜蛋白。这促使我们发现了VDAC在ERAD和ER-自噬中的关键作用。NCATS-SM0225通过钙内流和IP3R–MCU活性升高胞质、ER和线粒体钙。这种钙失衡增强了VDAC1–IP3R偶联并激活PERK，PERK磷酸化STIM1并驱动关键ERAD调节因子的降解。这些组分的丢失放大了PERK信号并选择性杀死癌细胞，同时保护正常细胞。这些发现揭示了VDAC在ERAD调节和钙信号传导中的癌症特异性作用，突出了一个治疗上可操作的脆弱点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过小分子调节ERAD，并阐明所发现ERAD抑制剂的分子靶点及其选择性杀伤癌细胞的机制。
- 核心机制
- 225结合VDAC1/2/3，增强VDAC1–IP3R偶联并促进钙内流及IP3R–MCU依赖的胞质、ER和线粒体钙升高，激活PERK磷酸化STIM1，进而经蛋白酶体降解HERP1、OS9和FAM8A1等ERAD组分，放大PERK促凋亡信号。
- 主要证据
- 高内涵筛选发现225；光亲和标记-质谱、MST（KD 3.13 µM）、CETSA和平面脂双层电生理证实其直接结合VDAC；钙传感器、VDAC敲除/敲低、IP3R抑制剂2-APB、MCU抑制剂RU265、钙螯合剂BAPTA-AM、PERK抑制剂GSK2606414及STIM1/PERK敲低验证钙-PERK-STIM1-ERAD降解链路；多种癌细胞与正常细胞及A375异种移植显示选择性杀伤。
- 研究意义
- 揭示VDAC在ERAD调控和钙信号中的癌症特异性作用，将VDAC确立为癌症选择性治疗靶点，并表明高内涵筛选可用于发现ERAD调节剂作为化学生物学工具和治疗候选物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
次级ERAD底物与ΔF508CFTR验证
确认初筛命中物对第二种ERAD底物CD3δ及CFTR生物合成的影响，优先选择候选化合物。
用CD3δ-drGFP报告复测62个化合物，并在稳定表达HA-ΔF508CFTR的BHK细胞中处理候选化合物24 h后免疫印迹检测CFTR的B、C糖基化形式。
验证225抑制ER dislocation与ERAD底物降解
确认225是否为ER dislocation和ERAD降解的抑制剂。
采用实时成像和终点荧光定量drGFP，结合CHX chase及NHK泛素化Re-IP，检测225对NHK、CD3δ降解及NHK泛素化的影响。
鉴定225的分子靶点为VDAC
通过光亲和标记和质谱确定225的直接结合蛋白。
合成可点击光亲和探针225-cc，与细胞孵育后UV交联，经CuAAC连接Dde-TAMRA-Biotin-Azide，链霉亲和素富集后SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定，并用各VDAC亚型敲除细胞验证标记。
验证225与VDAC1直接结合及通道功能调控
验证225与VDAC1的直接结合及其对VDAC1电压门控的影响。
用MST测定225与重组人VDAC1的KD，用CETSA检测细胞内VDAC热稳定性，并在平面脂双层中记录单通道和多通道电流。
解析VDAC-钙-PERK-STIM1-ERAD降解链路
确定225结合VDAC后引起钙失衡并导致ERAD组分降解的信号顺序。
用GCaMP6F、Mitycam和GCaMPer监测胞质、线粒体和ER钙；用VDAC敲除/敲低、无钙培养基、2-APB、RU265、BAPTA-AM、GSK2606414及STIM1/PERK敲低和共免疫沉淀验证各环节。
评估癌细胞选择性与体内抗肿瘤效果
验证225对癌细胞与正常细胞的选择性毒性及其在体内的抗肿瘤活性。
在16种癌细胞系和3种正常人原代细胞中检测HERP1、OS9、FAM8A1降解及WST细胞活力，并在A375黑色素瘤异种移植模型中每日腹腔注射225。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 最低必需培养基 | -- | -- |
| 成纤维细胞基础培养基 | ATCC | PCS-201-030 | |
| 无血清成纤维细胞生长添加剂 | ATCC | PCS-201-040 | |
| 真皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-200-030 | |
| 成人黑素细胞生长添加剂 | ATCC | PCS-200-042 | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| Leibovitz L-15培养基 | -- | -- | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 无钙DMEM | Invitrogen | 21068028 | |
| 药物处理 | 2-氨基乙基二苯硼酸酯 | MedChemExpress | HY-W009724 |
| BAPTA-AM钙螯合剂 | MedChemExpress | HY-100545 | |
| Efsevin | A1 BioChem Labs | 212070-75-2 | |
| Western blot | 抗HA11抗体 | Enzo Lifesciences | ENZ-ABS120 |
| 抗VDAC1抗体 | Biolegend | 820704 | |
| 抗STIM1抗体 | Biolegend | 621702 | |
| 抗PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3192S | |
| 抗HERP1抗体 | Cell Signaling Technology | 26739S | |
| 抗OS9抗体 | Cell Signaling Technology | 12497S | |
| 抗UBE2G2抗体 | Cell Signaling Technology | 63182S | |
| 抗HRD1抗体 | Cell Signaling Technology | 14773S | |
| 抗IP3R抗体 | NOVUS | NBP1-21398 | |
| 抗FAM8A1抗体 | ProteinTech | 24746-1-AP | |
| 抗ATF6抗体 | ProteinTech | 66563-1-1g | |
| 抗STIM2抗体 | ProteinTech | 21192-1-AP | |
| 抗磷酸化PERK抗体 | ProteinTech | 82534-1-RR | |
| 抗EMC3抗体 | ProteinTech | 67205-1-IG | |
| 抗EMC4抗体 | ProteinTech | 27708-1-AP | |
| 抗EMC7抗体 | ProteinTech | 27550-1-AP | |
| 抗VDAC2抗体 | Invitrogen | PA5-28106 | |
| 抗VDAC3抗体 | Invitrogen | PA5-100190 | |
| 抗YOD1抗体 | Invitrogen | PA5-70852 | |
| 抗HA-过氧化物酶抗体(3F10) | Roche | 12013819001 | |
| 抗Sel1L抗体 | Millipore Sigma | S3699 | |
| 抗DERLIN1抗体 | Millipore Sigma | D4443 | |
| 抗XTP3B抗体 | Millipore Sigma | SAB4200062 | |
| 抗DERLIN2抗体 | Millipore Sigma | D1194 | |
| β-肌动蛋白-过氧化物酶抗体 | Millipore Sigma | A3854 | |
| 抗BiP抗体 | BD Biosciences | 610978 | |
| 泛素-HRP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 HRP | |
| 抗IRE1α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390960 | |
| 抗GRP94抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393402 | |
| 抗UBE2J1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377002 | |
| 抗UBXD8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-98899 | |
| 抗CHOP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7351 | |
| 抗PARP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8007 | |
| 抗钙联蛋白抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 高内涵筛选 | 硼替佐米 | SelleckChem | S1013 |
| NMS-873 p97抑制剂 | MedChemExpress | HY-15713 | |
| Hoechst 33342核染料 | Invitrogen | H3570 | |
| 1536孔实验板 | Aurora | EBA141000A | |
| 超低基底1536孔膜底板 | Aurora | EBC241000A | |
| Fluorobrite DMEM培养基 | Gibco | A18967-01 | |
| 胎牛血清 | Cytivia | SH30071.03 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378-016 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15630-080 | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | |
| Multidrop Combi试剂分液器 | Thermo Fisher Scientific | 5840330 | |
| 小管金属尖分液卡盒 | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | |
| Acumen EX3微孔板细胞仪 | TTP Labtech | -- | |
| Opera Phenix Plus高内涵筛选系统 | -- | -- | |
| In Cell Analyzer 2000成像板阅读系统 | -- | -- | |
| Columbus图像数据存储与分析系统 | -- | -- | |
| IncuCyte S3活细胞分析系统 | -- | -- | |
| 质粒构建与转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| PERK siRNA | Cell Signaling Technology | 9024S | |
| 光亲和标记与质谱 | Dde-TAMRA-生物素-叠氮探针 | Click Chemistry Tools | 1367-1 |
| Pierce链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher | 88816 | |
| Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| UltiMate 3000纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher | -- | |
| AcclaimPepMap 100 C18捕获柱 | Thermo Fisher | -- | |
| MST | N端His标签重组人VDAC1 | Proteogenix | ARO-P13933 |
| RED-tris-NTA第二代染料 | NanoTemper | MO-L018 | |
| Monolith Premium毛细管 | NanoTemper | MO-K025 | |
| Monolith X仪器 | NanoTemper Technologies GmbH | -- | |
| 脂双层电生理 | 二油酰磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | -- |
| Axopatch 200B膜片钳放大器 | Axon Instruments | -- | |
| 任意波形发生器33220A | Agilent Technologies | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高内涵筛选 | NHK-drGFP细胞每孔约1000个、bortezomib终浓度6 µM、化合物11点复测浓度范围37 nM至38 µM、确认标准AC50<20 µM且抑制率>60% 阅读提示：Methods中drGFP-based high-content screening的Primary screening与Secondary Assay小节 |
| ER dislocation与ERAD降解验证 | 225浓度（0.625–5 µM用于drGFP）、BTZ 2 µM、CHX 50 µg/mL及追踪时间0–4 h、蛋白积累检测处理16 h 阅读提示：Fig. 2图注及Methods中CHX chase小节 |
| 靶点鉴定 | 225-cc 5 µM、竞争用225 80 µM、UV 355 nm照射20 min、Dde-TAMRA-Biotin-Azide 1 mM、链霉亲和素磁珠50 µL 阅读提示：Methods中Target identification using photoaffinity and clickable 225 and Mass Spectrometry小节 |
| VDAC1结合与功能 | MST中225起始100 µM十二点二倍稀释、蛋白终浓度50 nM、KD 3.13 µM；CETSA用2 µM 225处理1 h；脂双层DOPC/DOPE 1:1、1 M KCl、pH 7.4，225 100–400 nM 阅读提示：Fig. 5图注及Methods中MST、CETSA和VDAC1 gating小节 |
| 钙-PERK-STIM1链路验证 | 225 2 µM处理22 h用于钙检测、无钙DMEM、2-APB 200 µM预处理1 h、RU265 10或25 µM预处理1 h、BAPTA-AM 20 µM预处理1 h、GSK2606414 2 µM预处理1 h 阅读提示：Fig. 6、Fig. 9、Fig. 10图注及对应Results段落 |
| 癌细胞选择性与体内实验 | 225 2 µM处理24 h用于免疫印迹、WST前处理48 h、A375细胞2×10⁶皮下接种、n=8只/组、225 20 mg/kg每日腹腔注射、第21天取样 阅读提示：Fig. 7图注及Methods中Xenograft小节 |