多组学筛选鉴定TNK2/ACK1为免疫抑制相关基因
鉴定与PDAC免疫抑制微环境相关的关键因子。
整合空间转录组（10例）、scRNA-seq（13例）和TCGA/GTEx RNA-seq数据，定义冷/热肿瘤区域并筛选差异表达基因，取交集发现TNK2/ACK1。
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靶向TNK2/ACK1逆转免疫抑制性肿瘤微环境并与免疫化疗在胰腺癌中协同作用
Targeting TNK2/ACK1 reverses the immunosuppressive tumor microenvironment and synergizes with immunochemotherapy in pancreatic cancer.
实验完整度
高整合空间转录组、单细胞测序、RNA-seq分析，结合细胞系、类器官、同种异体移植和自发PDAC小鼠模型，进行功能与机制验证。
主要模型
人PDAC细胞系（SW1990、Capan-2、MIA PaCa-2、BxPC-3、L3.7等） 小鼠PDAC细胞系（KPC#1、KPC#2、KPC#3） 人PDAC类器官（PDAC#1-6） KPC小鼠自发PDAC模型及原位/皮下移植模型
重点核对
KPC#1或KPC#3细胞原位接种C57BL/6、CD8⁺ T细胞清除或BALB/c裸鼠的模型分组 AIM100（6 mg/kg，每4天腹腔注射）和(R)-9b（25 mg/kg，每5天腹腔注射）的剂量与给药方案 白蛋白结合型紫杉醇（200 μg/只）和吉西他滨（500 μg/只）每4天腹腔注射，αPD-1（200 μg/只）第4、7、10天注射 CD8⁺ T细胞与KPC细胞直接共培养比例10:1及间接共培养（0.4 μm孔径）对照 HVEM敲低/过表达与TNK2过表达/敲低的表观遗传学验证（原位模型，n=8）
摘要
胰腺导管腺癌（PDAC）因其侵袭性和有限的治疗选择而仍然高度致命，免疫治疗的疗效受到独特的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的限制。在本研究中，我们将TNK2/ACK1确定为PDAC中免疫抑制性TME的关键调节因子。TNK2/ACK1在PDAC中显著上调，至少部分是通过基因扩增和KRAS-G12突变实现的。机制上，TNK2/ACK1直接磷酸化并激活STAT5A以诱导免疫检查点HVEM的表达，HVEM通过其受体BTLA抑制CD8⁺ T细胞功能。用AIM100或(R)−9b对TNK2/ACK1进行药理学靶向可增强CD8⁺ T细胞的活化和细胞毒性，同时重编程TME。此外，将TNK2/ACK1抑制剂与抗PD-1免疫治疗或与白蛋白结合型紫杉醇加吉西他滨联合使用，在同种异体移植和自发PDAC模型中均显示出有前景的抗肿瘤疗效。总体而言，我们的发现揭示了一种免疫逃逸机制，并为在PDAC中开发定制免疫治疗策略提供了潜在框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TNK2/ACK1是否以及如何调控PDAC的免疫抑制性肿瘤微环境，并能否通过靶向TNK2/ACK1改善免疫治疗疗效？
- 核心机制
- TNK2/ACK1直接磷酸化并激活STAT5A（Y694位点），促进免疫检查点HVEM的转录，HVEM通过与CD8⁺ T细胞上的BTLA受体结合抑制CD8⁺ T细胞功能，导致免疫逃逸。
- 主要证据
- 空间转录组、scRNA-seq和RNA-seq整合分析显示TNK2/ACK1与免疫抑制相关；mIHC和流式细胞术显示TNK2/ACK1负相关于CD8⁺ T细胞浸润和功能；体外共培养、类器官和原位小鼠模型验证TNK2/ACK1通过HVEM-BTLA轴抑制CD8⁺ T细胞；Co-IP、体外激酶实验、ChIP-qPCR和双荧光素酶实验证实TNK2/ACK1-STAT5A-HVEM机制；TNK2/ACK1抑制剂AIM100或(R)-9b与αPD-1及AG化疗联合在移植和自发PDAC模型中显示协同抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 揭示PDAC免疫逃逸的新机制，并提供以TNK2/ACK1为靶点、联合免疫检查和化疗的潜在治疗策略框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TNK2/ACK1在PDAC中的表达及临床相关性
验证TNK2/ACK1在PDAC中的表达水平及其与预后的关系。
通过IHC、FISH、多数据库表达分析和生存分析，评估TNK2/ACK1在PDAC组织中的表达及与OS/PFS的相关性。
探究TNK2/ACK1上调机制
明确TNK2/ACK1在PDAC中高表达的驱动因素。
分析拷贝数变异数据、KRAS突变相关性，并使用KRAS抑制剂（MRTX1133、BI-2865）和ERK抑制剂（SCH772984）处理PDAC细胞系，检测TNK2表达变化。
评估TNK2/ACK1对CD8⁺ T细胞浸润和功能的影响
验证TNK2/ACK1是否抑制CD8⁺ T细胞浸润和功能。
利用mIHC、空间转录组和scRNA-seq分析TNK2/ACK1与CD8⁺ T细胞的空间关系；通过KPC细胞原位移植模型（TNK2过表达/敲低）及CD8⁺ T细胞清除实验，流式检测CD8⁺ T细胞丰度、活性和耗竭。
体外验证TNK2/ACK1通过细胞接触抑制CD8⁺ T细胞
明确TNK2/ACK1对CD8⁺ T细胞的抑制作用是否依赖细胞间直接接触。
直接和间接共培养KPC细胞与活化CD8⁺ T细胞或OT-I CD8⁺ T细胞，流式检测细胞因子、耗竭标志物、增殖和细胞毒性。
鉴定TNK2/ACK1下游效应分子HVEM
寻找介导TNK2/ACK1抑制CD8⁺ T细胞的表面分子。
对TNK2过表达KPC#3细胞进行膜蛋白质谱，与免疫调节因子、膜蛋白和PDAC上调基因取交集，筛选出HVEM并进行功能验证。
验证HVEM在TNK2/ACK1介导的CD8⁺ T细胞抑制中的必要性
确定HVEM是否介导TNK2/ACK1对CD8⁺ T细胞功能的抑制。
在TNK2过表达KPC#3细胞中敲低HVEM，在TNK2敲低KPC#1细胞中过表达HVEM，建立原位移植模型，检测肿瘤生长和CD8⁺ T细胞功能。
验证HVEM-BTLA相互作用介导CD8⁺ T细胞抑制
明确HVEM通过BTLA受体抑制CD8⁺ T细胞功能。
分析BTLA在CD8⁺ T细胞上的表达，使用αBTLA抗体阻断BTLA，在共培养体系中检测CD8⁺ T细胞活性和细胞毒性。
阐明TNK2/ACK1磷酸化STAT5A并激活HVEM转录的机制
揭示TNK2/ACK1调控HVEM表达的分子机制。
通过磷酸化蛋白质谱和互作蛋白质谱筛选STAT5A，利用Co-IP、体外激酶实验、ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证TNK2/ACK1-STAT5A-HVEM轴。
评估TNK2/ACK1抑制剂与αPD-1及化疗的协同抗肿瘤效果
验证靶向TNK2/ACK1能否逆转免疫抑制并与免疫化疗协同。
在KPC#1或KPC#3原位移植模型及KPC自发PDAC模型中，使用AIM100或(R)-9b单药、与αPD-1或AG化疗联合，评估肿瘤生长、生存期和免疫指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 低生长因子基质胶 | Corning | 356230 | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634010 | |
| 类器官培养 | Noggin蛋白 | bioGenous | 807-NOG |
| R-spondin蛋白 | bioGenous | 861-RS1 | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | AF-100-15 | |
| 成纤维细胞生长因子10 | bioGenous | 816-FGF | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A7250 | |
| 胃泌素 | R&D | 3006 | |
| 动物实验 | 抗CD8a抗体 | Bio X cell | #BE0061 |
| 抗PD-1抗体 | Bio X Cell | #BE0146 | |
| AIM100 | MCE | HY-15290 | |
| (R)-9b | Sigma-Aldrich | SML2073 | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | ZSGB | ZLI-9019 |
| 多重免疫组化 | Opal七色手动免疫组化试剂盒 | PerkinElmer | NEL811001KT |
| 流式细胞术 | CD8抗体 | Biolegend | 100706 |
| BTLA抗体 | Biolegend | 134804 | |
| PD-1抗体 | Thermo | 63-9981-82 | |
| TIM3抗体 | Biolegend | 134014 | |
| 颗粒酶B抗体 | Biolegend | 396408 | |
| TNF-α抗体 | Biolegend | 506329 | |
| IFN-γ抗体 | Biolegend | 505838 | |
| CD8⁺ T细胞分离与活化 | 初始CD8⁺ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-104-075 |
| CD8⁺ T细胞活化 | CD3/CD28 Dynabeads | Thermo | 11452D |
| CD8⁺ T细胞培养 | 重组IL-2 | PeproTech | 200-02 |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0016 |
| 细胞增殖检测 | CFSE染料 | BioLegend | 423801 |
| 细胞凋亡检测 | Caspase-3/7绿色荧光探针 | Thermo | R37111 |
| Hoechst33342 | Thermo | H1399 | |
| Annexin V/PI溶液 | BD | 556547 | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo | 15596026 |
| RT-qPCR | M-MLV逆转录酶 | Takara | 2641A |
| TransStart Green Q-PCR SuperMix试剂盒 | TransGen | AQ101-01 | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G磁珠 | Thermo | 88804 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| ECL化学发光试剂盒 | Millipore | WBKLS0500 | |
| ChIP | EZ-ChIP试剂盒 | Millipore | 17-371 |
| 双荧光素酶实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 体外激酶实验 | 激酶反应缓冲液 | CST | #9802 |
| ATP | CST | #9804 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原位移植瘤模型构建与分组 | 细胞接种量（1×10⁵细胞/40 μl Matrigel）、小鼠品系（C57BL/6、CD8⁺ T细胞清除C57BL/6、BALB/c裸鼠）、周龄（6–8周）、雌性、分组及样本量（n=8） 阅读提示：Methods中Mouse models and Intervention approaches第(2)条和图3、图5图注 |
| TNK2/ACK1抑制剂给药方案 | AIM100剂量6 mg/kg每4天腹腔注射，(R)-9b剂量25 mg/kg每5天腹腔注射，溶剂对照 阅读提示：Methods中Mouse models and Intervention approaches第(6)条和补充图15–18图注 |
| 联合治疗给药方案 | 白蛋白结合型紫杉醇200 μg/只和吉西他滨500 μg/只每4天腹腔注射，αPD-1 200 μg/只第4、7、10天注射 阅读提示：Methods中Mouse models and Intervention approaches第(6)条和图7及补充图16–19图注 |
| CD8⁺ T细胞与肿瘤细胞共培养 | 直接共培养细胞比例（KPC 1×10⁴与CD8⁺ T 2×10⁵）、间接共培养小室孔径（0.4 μm）、共培养时间（48 h或6 h）、OT-I与KPC-OVA比例（1:10或1:20） 阅读提示：Methods中The co-culture models of PDAC cells and CD8+T cells in vitro和图4图注 |
| HVEM表观遗传学验证模型 | KPC#3 TNK2过表达+HVEM敲低和KPC#1 TNK2敲低+HVEM过表达原位模型，每组n=8 阅读提示：图5图注和补充图10 |