II期临床试验评估纳武利尤单抗联合伊匹木单抗疗效
评估纳武利尤单抗联合伊匹木单抗在局部晚期或转移性RMC患者中的客观缓解率及安全性。
入组10例RMC患者，接受纳武利尤单抗3 mg/kg每3周联合伊匹木单抗1 mg/kg每3周最多4剂，后续纳武利尤单抗480 mg每4周维持，直至疾病进展或不可耐受毒性；评估ORR、PFS、OS及不良事件。
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纳武利尤单抗联合伊匹木单抗在肾髓质癌中诱导超进展：一项II期试验结果及临床前证据
Nivolumab plus ipilimumab induce hyper-progression in renal medullary carcinoma: results of a phase II trial and preclinical evidence.
实验完整度
高含II期临床试验患者样本scRNA-seq、CyTOF、mIF，以及免疫健全SM-GEMM小鼠模型的功能与机制验证（IFNGR1敲除、p300抑制剂）
主要模型
RMC患者肿瘤组织及外周血样本 免疫健全体细胞嵌合基因工程小鼠RMC模型（SM-GEMM） MSRT1小鼠RMC细胞系（含IFNGR1敲除衍生物） DOHH2非霍奇金淋巴瘤细胞系
重点核对
临床试验：纳武利尤单抗3 mg/kg每3周联合伊匹木单抗1 mg/kg每3周，最多4剂，后续纳武利尤单抗480 mg每4周维持 小鼠体内实验：抗PD-1与抗CTLA-4各5 mg/kg腹腔注射，每3天一次共8剂；IACS-16898 50 mg/kg口服灌胃 IFNGR1敲除验证：CRISPR敲除MSRT1细胞IFNGR1，Western blot检测MEK/ERK及p300 超进展定义：治疗开始后8周内进展，可测病灶最小增加10 mm，靶病灶总和较基线增加≥40%和/或增加≥20%且至少两个不同器官出现新病灶 scRNA-seq样本：基线7例、治疗后2例RMC患者新鲜肿瘤活检组织
摘要
肾髓质癌（RMC）患者的治疗选择有限。本文报告一项抗PD1药物纳武利尤单抗联合抗CTLA4药物伊匹木单抗治疗RMC患者的II期临床试验（NCT03274258）结果，主要终点为客观缓解率。由于全部10例接受治疗的患者均出现快速疾病进展，试验在预设中期分析时因无效而停止入组。10例患者中5例符合影像学超进展标准，中位无进展生存期（次要终点）为1.38个月（95%置信区间：1.28，1.60）。在一项事后单细胞RNA测序分析中，来自RMC患者接受纳武利尤单抗联合伊匹木单抗治疗前后的数据表明，免疫检查点治疗（ICT）触发了干扰素-γ反应，在肿瘤细胞中诱导了由CEBPB/p300轴调控的“髓系模拟”程序，该程序与增殖和超进展相关。在使用免疫健全的体细胞嵌合基因工程小鼠RMC模型的临床前实验中，联合ICT加速了肿瘤生长，同时激活了髓系相关的转录回路。选择性药理学抑制p300可抑制该程序并恢复对ICT的敏感性。这些发现揭示了RMC对ICT耐药的适应性机制，并支持靶向主要髓系调控因子以实现治疗获益。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 纳武利尤单抗联合伊匹木单抗在肾髓质癌患者中的疗效如何，以及RMC对免疫检查点治疗耐药或超进展的机制是什么。
- 核心机制
- ICT触发的IFNγ反应通过肿瘤细胞上调的IFNGR1信号激活CEBPB/p300轴，诱导肿瘤细胞“髓系模拟”转录程序，促进增殖和超进展；药理学抑制p300可抑制该程序并恢复对ICT的敏感性。
- 主要证据
- II期临床试验中10例RMC患者全部快速进展，5例符合超进展标准，中位PFS 1.38个月；患者肿瘤scRNA-seq、CyTOF和多色免疫荧光显示ICT后肿瘤细胞S100A9、IFNGR1、CEBPB、EP300上调及髓系相似性增加；免疫健全小鼠RMC模型中ICT加速肿瘤生长并增加髓系标志物，IFNGR1敲除或p300抑制剂IACS-16898可逆转超进展并恢复ICT敏感性。
- 研究意义
- 揭示RMC对ICT耐药的适应性机制，支持靶向主要髓系调控因子p300以使免疫治疗获益，并为未来联合p300抑制与ICT的临床试验提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
患者肿瘤样本单细胞转录组分析
探究ICT后RMC肿瘤细胞的转录重编程及与超进展相关的分子特征。
对基线7例和治疗后2例RMC患者新鲜肿瘤活检组织进行scRNA-seq，分析细胞类型、差异表达基因、通路富集、肿瘤细胞熵及与髓系细胞的转录相似性。
患者外周血和肿瘤组织免疫分析
验证ICT后免疫微环境变化及肿瘤细胞髓系标志物表达。
对基线和治疗后PBMC进行CyTOF分析；对肿瘤组织进行多重免疫荧光检测CD8、IFNγ、S100A9、IFNGR1等；对纵向肿瘤组织进行bulk RNA-seq。
免疫健全小鼠RMC模型验证ICT超进展
在可控实验条件下验证ICT诱导的超进展和髓系模拟。
将MSRT1细胞原位注射至C57BL/6J小鼠右肾，给予抗PD-1联合抗CTLA-4或IgG对照，评估原发肿瘤质量、转移负荷、增殖和髓系标志物。
IFNGR1敲除验证机制
验证IFNGR1在介导ICT诱导的髓系模拟和超进展中的作用。
用CRISPR敲除MSRT1细胞IFNGR1，体外IFNγ刺激检测MEK/ERK和F4/80；将IFNGR1KO细胞原位移植至小鼠，给予ICT或IgG对照，评估肿瘤生长和p300蛋白。
p300抑制剂IACS-16898药理学验证
验证药理学抑制p300能否抑制髓系模拟并恢复RMC对ICT的敏感性。
开发口服CBP/p300溴结构域抑制剂IACS-16898，体外检测其结合活性和选择性；在小鼠RMC模型中联合ICT给药，评估肿瘤质量、H3K27乙酰化和F4/80表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | NORGEN总RNA纯化试剂盒 | NORGEN BIOTEK CORP | 37500 |
| RNA纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter Life Sciences | -- |
| RNA定量 | Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| RNA完整性检测 | Agilent RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| cDNA合成 | Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | -- |
| cDNA定量 | Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| cDNA片段化 | Covaris E220聚焦超声仪 | Covaris | -- |
| 文库构建 | SureSelect XT低起始量试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Sciclone G3 NGSx工作站 | PerkinElmer, Inc. | -- | |
| Herculase II Fusion DNA聚合酶 | Agilent Technologies | -- | |
| 文库片段大小检测 | TapeStation 4200 | Agilent Technologies | -- |
| 外显子捕获 | Agilent SureSelect人全外显子v4探针 | Agilent Technologies | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 组织消化 | Liberase TM | MilliporeSigma | -- |
| DNase I | MilliporeSigma | -- | |
| 红细胞裂解 | ACK裂解缓冲液 | ThermoFisher | A1049201 |
| 单细胞封装 | Chromium iX仪器 | 10x Genomics | -- |
| 抗体标记 | Maxpar X8抗体标记试剂盒 | Standard BioTools | -- |
| CyTOF存活染色 | Cell-ID顺铂198Pt | Standard BioTools | -- |
| CyTOF Fc受体封闭 | Human TruStain FcX | Biolegend | -- |
| CyTOF样本条形码 | 20重CD45活细胞条形码试剂盒 | Standard BioTools | -- |
| CyTOF固定破膜 | Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | -- |
| CyTOF检测 | Helios质谱流式细胞仪 | Standard BioTools | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 多重免疫荧光（患者） | Opal 7免疫组化试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL797001KT |
| Opal Polaris 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | |
| Opal Polaris 780试剂盒 | Akoya Biosciences | FP1501001KT | |
| Vectra Polaris 1.0.13 | Akoya Biosciences | -- | |
| 多重免疫荧光（小鼠和患者） | Opal 3重手动检测试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL810001KT |
| 免疫荧光（体外） | 兔F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 |
| 大鼠Ly6c抗体 | BioRad | MCA2389GA | |
| 兔CD11b抗体 | Abcam | ab133357 | |
| 兔CD11c抗体 | Cell Signaling Technology | 97585 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 鬼笔环肽 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 |
| 磷酸化MEK1/2 (Ser217/221)抗体 | Cell Signaling Technology | 9121 | |
| Ki-67 (D2H10)抗体 | Cell Signaling Technology | 9027 | |
| GFP (D5.1)抗体 | Cell Signaling Technology | 2956 | |
| NovaRED过氧化物酶底物 | Vector Lab | SK-4800 | |
| 体内ICT治疗 | InVivoPlus多克隆叙利亚仓鼠IgG | Bio X Cell | BP0087 |
| InVivoPlus抗小鼠CTLA-4 (CD152)克隆9H10 | Bio X Cell | BP0131 | |
| InVivoPlus抗小鼠PD-1 (CD279)克隆RMP1-14 | Bio X Cell | BP0146 | |
| 组蛋白提取 | 组蛋白提取试剂盒 | Abcam | ab113476 |
| AlphaScreen | GST标签CBP（1081–1197残基） | BPS Bioscience | -- |
| GST标签BRD4（49–170残基） | BPS Bioscience | -- | |
| 生物素化四乙酰化H4(1–21)肽 | AnaSpec | 64989 | |
| 谷胱甘肽AlphaLISA受体珠 | PerkinElmer | AL109 | |
| 链霉亲和素供体珠 | PerkinElmer | 676002 | |
| 细胞增殖实验 | Cell Titer GLO检测 | Promega | -- |
| qRT-PCR | RNeasy迷你RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| BCL6 Taqman探针 | Thermo Fisher | Hs00153368_m1 | |
| 人RPLPO内参 | Thermo Fisher | 4326314E | |
| Western blot（组蛋白） | 总H3抗体 | Cell Signaling Technologies | 4499 |
| 乙酰化H3K27抗体 | Cell Signaling Technologies | 8173 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| II期临床试验 | 纳武利尤单抗3 mg/kg每3周联合伊匹木单抗1 mg/kg每3周最多4剂，后续纳武利尤单抗480 mg每4周维持；主要终点ORR；超进展定义 阅读提示：Methods中Clinical trial design、Clinical trial endpoints and assessments及Definition of hyperprogression小节 |
| 患者scRNA-seq | 基线7例、ICT后2例；样本来源器官部位；细胞质控标准（>200基因、<20%线粒体 reads、<6500基因） 阅读提示：Methods中ScRNA-seq data processing and analysis小节及Supplementary Table S3 |
| 小鼠RMC模型ICT实验 | MSRT1细胞500,000个原位注射右肾；抗PD-1和抗CTLA-4各5 mg/kg腹腔注射每3天一次共8剂；每组n=6；第30天MRI 阅读提示：Methods中In vivo treatment study with combination immune checkpoint therapy小节及Figure 4 legend |
| IFNGR1敲除实验 | CRISPR sgRNA序列AAAAAGAATCTGACTATGCA；IFNγ 100 ng/mL处理48 h；IFNGR1KO与WT细胞对比；小鼠分组样本量 阅读提示：Methods中Single-guide RNA design and validation、Immunofluorescence in vitro experiment小节及Figure 6、7 legends |
| IACS-16898联合ICT实验 | IACS-16898 50 mg/kg口服灌胃每日两次，周末停药两天；ICT抗PD-1/抗CTLA-4各5 mg/kg；每组n=5-6；第30天评估 阅读提示：Methods中In vivo treatment study with combination immune checkpoint therapy小节及Figure 8 legend |