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        单细胞和空间转录组学揭示三级淋巴结构在胃癌中的预后功能

        Single-cell and spatial transcriptomics implicate a prognostic function of tertiary lymphoid structures in gastric cancer.

        作者信息Yanchun Wang, Guangyu Zhang, Xin Zhang, Gaoke Liu, Lihua Zhang, Lei Chen, Shuli Sang, Sheng Yao, Yang Fei, Zhichao Tian, Yu Zang, Hongwei Wang, Yiping Dong, Chunjie Liu, Xizhao Chen, Yan Liu, Min Zhang
        PMID41290589
        期刊Nat Commun
        发布时间2025-11
        DOI10.1038/s41467-025-65421-8
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含110例队列预后分析、25例scRNA-seq、5例ST-seq、多重免疫荧光验证及ACKR1过表达内皮细胞功能实验

        主要模型

        胃癌患者肿瘤组织（scRNA-seq，25例） 胃癌患者肿瘤组织（空间转录组测序，5例） ACKR1过表达内皮细胞（ACKR1OE EC） 外周血单个核细胞来源T淋巴细胞

        重点核对

        ACKR1OE EC分别用PBS、50 ng/mL CXCL13、5 ng/mL TNF或两者联合处理24 h（n=4） TLC迁移实验：Transwell共培养24 h后计数TLC（n=4） TLS空间分型：iTLS、pTLS、dTLS，由三名病理学家基于至少三张H&E切片独立评估 scRNA-seq纳入iTLS-GC 10例、pTLS-GC 9例、dTLS-GC 6例，ST-seq纳入iTLS-GC 2例、pTLS-GC 2例、dTLS-GC 1例 免疫治疗队列按CR/PR为应答、SD/PD为无应答分组

        摘要

        三级淋巴结构（TLS）已成为癌症中重要的预后和免疫治疗指标，其临床意义受空间分布模式和密度调控。本研究对30例按TLS空间定位模式分层的胃癌（GC）标本进行了整合的单细胞和空间转录组分析。比较分析显示，与瘤周TLS（pTLS）和荒漠TLS（dTLS）肿瘤亚型相比，瘤内TLS（iTLS）丰富的肿瘤中CXCL13+ T淋巴细胞（TLC）、CXCR5+生发中心B淋巴细胞（gc_B细胞）、LAMP3+CD80+活化树突状细胞（DC）和SELP+ACKR1+高内皮微静脉（HEV）细胞显著富集。多模态细胞-细胞相互作用分析和功能实验表明，HEV表达的VCAM1和ICAM1通过CXCL13-ACKR1通路招募并激活CXCL13+ TLC，后者通过CXCL13-CXCR5依赖性串扰与B淋巴细胞相互作用，促进TLS形成。我们进一步开发了一个单细胞/空间TLS特征，能够捕获含iTLS肿瘤的细胞生态系统，并在GC患者中显示出对免疫治疗结局的预测价值。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        不同TLS空间分布状态的胃癌其肿瘤微环境细胞与分子异质性如何，能否据此构建预测免疫治疗结局的特征。
        核心机制
        SELP+ACKR1+ HEV通过VCAM1/ICAM1及CXCL13-ACKR1通路招募CXCL13+ TLC，后者经CXCL13-CXCR5与CXCR5+ gc_B相互作用，促进TLS形成。
        主要证据
        25例scRNA-seq与5例ST-seq显示iTLS-GC富集CXCL13+ TLC、gc_B、LAMP3+ DC和HEV；多重免疫荧光验证共定位；ACKR1OE EC实验显示CXCL13上调VCAM1/ICAM1并促进TLC迁移。
        研究意义
        定义的ssTLS特征可区分抗PD1治疗应答与非应答病例（AUC 0.795），有助于评估胃癌免疫治疗预后并制定治疗策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        胃癌TLS空间分型与预后分析

        明确TLS空间分布与胃癌预后及免疫治疗疗效的关系

        对110例胃癌患者行病理检查与生存随访，按H&E将TLS分为iTLS、pTLS、dTLS，Kaplan-Meier分析OS和PFS，并与免疫治疗疗效做相关分析

        2

        单细胞与空间转录组图谱构建

        解析不同TLS状态胃癌的细胞组成与空间特征

        对25例胃癌标本行scRNA-seq，对5例标本行ST-seq，质控后对88,100个细胞聚类为11类主要细胞类型，并做空间聚类

        3

        免疫细胞亚群解析

        刻画不同TLS状态下TLC、BLC、髓系细胞亚群的组成与功能特征

        对TLC/NK、BLC、髓系细胞分别进行无监督聚类、差异表达、GSVA、TCR克隆扩增与拟时序分析

        4

        细胞间相互作用分析

        识别TLS形成相关的配体-受体相互作用

        用CellChat分析TLC、BLC、DC、HEV及CAF之间的配体-受体对，并用ST-seq和多重免疫荧光验证空间共定位

        5

        ACKR1-HEV招募TLC的功能验证

        验证CXCL13-ACKR1轴对TLC招募的作用

        构建ACKR1过表达内皮细胞，用CXCL13/TNF处理后qPCR检测VCAM1和ICAM1，并用Transwell实验检测TLC迁移

        6

        ssTLS特征构建与验证

        评估TLS相关特征对免疫治疗应答的预测价值

        基于scRNA-seq与ST-seq定义的细胞特征构建ssTLS评分，在免疫治疗队列中评估其与PFS、OS及应答的关系，并计算ROC曲线

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        苏木精-伊红染色多重免疫荧光染色多光谱成像
        单细胞与空间转录组分析
        单细胞RNA测序单细胞TCR测序空间转录组测序UMAP降维拷贝数变异分析
        验证分子表达变化
        定量聚合酶链反应基因集富集分析基因集变异分析基因本体富集分析
        验证细胞功能变化
        Transwell迁移实验体外内皮细胞分化实验荧光激活细胞分选
        验证机制链路
        细胞-细胞通讯分析TCR克隆扩增分析拟时序轨迹分析
        数据分析与统计
        Kaplan-Meier生存分析Cox比例风险模型受试者工作特征曲线分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        组织保存组织保存液Miltenyi Biotec130-100-008
        组织清洗杜氏磷酸盐缓冲液SolarbioD1040
        组织解离MACS人肿瘤解离试剂盒Miltenyi BiotecDS130-095-929
        红细胞裂解红细胞裂解液SolarbioR1010
        多重免疫荧光染色PANO 7重免疫组化试剂盒Panovue10004100100
        抗原修复抗原修复液Panovue10020020500
        抗原修复液Panovue10019020500
        多重免疫荧光染色荧光试剂盒Panovue10021001010
        核染色4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚Sigma-AldrichD9542
        scRNA-seq文库构建Chromium单细胞5′文库与凝胶珠试剂盒10X GenomicsPN-1000165
        scRNA-seq文库定量Qubit高灵敏度DNA检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ32851
        scRNA-seq与TCR文库构建Chromium Next GEM单细胞5′试剂盒v210X GenomicsPN-1000263
        TCR富集Chromium单细胞V(D)J富集试剂盒（人T细胞）10X GenomicsPN-1000005
        空间转录组测序Visium CytAssist仪器10x GenomicsCG000495
        Superfrost™ Plus显微镜载玻片Fisherbrand™--
        AMPure XP选择磁珠BECKMAN COULTERA63882
        质粒构建pCMV-HA-FLAG-ACKR1 (Neo)质粒Miaolingbio--
        细胞转染Lipofectamine Stem转染试剂Thermo FisherSTEM00003
        稳定细胞系筛选杀稻瘟菌素SBeyotimeST018
        内皮分化激活素APeproTech120-14P-500UG
        骨形态发生蛋白4PeproTech120-05-5UG
        CHIR99021SelleckS2924
        成纤维细胞生长因子2PeproTech100-18B-50UG
        GDC-0941Cellagen Technology957054-30-7
        佛司可林SelleckS2449
        SB-505124SelleckS2186
        血管内皮生长因子PeproTech100-20-10UG
        XAV939SelleckS1180
        DMH1SelleckS7146
        RO4929097SelleckS1575
        PD0325901SelleckS1036
        RNA提取TRIzol试剂Invitrogen15596026
        逆转录HiScript III一步法RT SuperMix qPCR试剂盒VazymeR333
        PBMC分离淋巴细胞分离液SolarbioP8610
        TLC富集CD3/28分离激活磁珠SeafromGMP-TL603-1000
        TLC迁移实验Transwell小室LABSELECT02225110E

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        TLS空间分型与预后分析
        TLS分类标准（iTLS/pTLS/dTLS）及混合TLS归为iTLS的判定规则；三名病理学家独立评估，每例至少三张H&E切片；iTLS n=48、pTLS n=45、dTLS n=17
        阅读提示：Methods“Clinical cohorts, immunotherapy response, and prognosis of GC”及Fig. 1b图注
        单细胞与空间转录组取样
        样本未接受化疗或放疗；scRNA-seq iTLS-GC 10例、pTLS-GC 9例、dTLS-GC 6例；ST-seq iTLS-GC 2例、pTLS-GC 2例、dTLS-GC 1例
        阅读提示：Results第一部分及Fig. 1c、Fig. 2a图注
        ACKR1OE EC处理与检测
        CXCL13 50 ng/mL、TNF 5 ng/mL、处理24 h、n=4；qPCR以GAPDH归一化
        阅读提示：Methods“Quantitative polymerase chain reaction”及Fig. 6j图注
        TLC迁移实验
        1×10^5 TLC、5 μm插入小室、共培养24 h、n=4、VIVO-15培养基含200 IU/mL IL-2
        阅读提示：Methods“TLC recruitment in the TLC/ACKR1OE EC transwell system”及Fig. 6k图注
        ssTLS特征评分与免疫治疗预测
        ssTLS基因列表；免疫治疗非应答n=33、应答n=11；按中位数分组；AUC=0.795
        阅读提示：Results最后一部分及Fig. 7c–g图注

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